李志芳 秦岭 贺若曦 胡新月 汤渝玲 胡成平 冯俊涛



·论著·

神经生长因子通过c-fos促进支气管上皮细胞NK-1R表达

李志芳1秦岭1贺若曦1胡新月1汤渝玲2胡成平1冯俊涛1

目的探讨神经生长因子(NGF)通过c-fos影响支气管上皮细胞NK-1R的表达。方法 以人支气管上皮细胞(NHBEC)为研究对象，通过阳离子脂质体将c-fos siRNA 转染至细胞内，然后用NGF干预。实验设五组：对照组、NGF干预组、NGF+c-fos siRNA组、NGF+空白脂质体组、NGF+非特异性dsRNA组。转染12 h后，用NGF干预60 min，采用 Western blot法测定c-fos蛋白表达，采用免疫细胞化学法和RT-PCR从蛋白和mRNA水平观察细胞中NK-1R的表达。结果与对照组比，NGF组c-fos蛋白、NK-1R蛋白和NK-1RmRNA表达均明显增加(P<0.01)；与NGF组比，NGF+c-fos siRNA组中c-fos蛋白、NK-1R蛋白和NK-1RmRNA表达均明显减少(P<0.01)，而NGF组、NGF+空白脂质体组、NGF+非特异性dsRNA组之间的c-fos蛋白、NK-1R蛋白和NK-1RmRNA表达无显著差异。结论NGF可通过c-fos促进支气管上皮细胞中NK-1R的表达，介导哮喘神经源性炎症，RNAi技术可以减少NGF诱导的人支气管上皮细胞c-fos蛋白及NK-1R的表达。

支气管哮喘； 神经生长因子； c-fos； NK-1R

神经生长因子(nerve growth factor, NGF)是参与调节哮喘中神经-内分泌-免疫网络失衡机制的重要因素[1-2]。哮喘发病过程中，NGF刺激神经节使感觉神经肽(sensory nerve peptide, SP)合成增多，随后SP由神经突触分泌并作用于气道上皮细胞，导致神经源性炎症的产生。此外，在NGF作用下，分布在支气管上皮细胞表面的SP的主要受体NK-1R表达也明显增强[3-5]。丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号通路是迄今为止研究最为透彻的一条通路，它参与了支气管哮喘发病的多个关键过程。本研究组前期的研究结果提示NGF可上调支气管上皮细胞内神经源性炎症的信号转导通路Ras/MAPK/c-fos的表达来介导哮喘神经源性炎症[6]。而在对大鼠纹状体内源性镇痛机制的研究中发现，c-fos与NK-1R的表达量呈正相关[7]。因此，本研究中我们选定下游信号分子c-fos作为研究靶点，构建特异性siRNA抑制c-fos表达，从正反两方面观察NGF是否通过c-fos影响支气管上皮细胞NK-1R的表达。为探索NGF参与的哮喘神经源性机制提供理论依据和研究线索。

材料与方法

一、 材料与试剂

siRNA合成试剂盒(美国Ambion公司)、DMEM培养基(美国Hycolone公司)；Pgenesil-1质粒表达载体(武汉晶赛生物工程公司)及酶类：BamHI、HindⅢ、T4 DNA Ligase、EcoRI(New England Biolabs)。线性化Pgenesil-1质粒表达载体及酶类：T4 DNA Ligase、BamHI、HindⅢ、SalI、PstI、EcoRI、XbaI、SacI(NEB公司)。siRNA荧光素标记试剂盒及RNaseZap(美国Ambion公司)；人支气管上皮细胞株(NHBEC)(湖南远泰生物工程公司)；大肠杆菌(DH5α)(武汉晶赛生物工程公司)；HindⅢ Marker、EcoT-14 I Marker、DL2000 Marker(New England Biolabs)；NK-1R的引物和扩增β-Actin(武汉伯杰生物工程公司)，rTaq、dNTP、Oligo dT、Trizol(New England Biolabs公司)；PD98059、AG490、NGF及 PMA (美国Sigma公司)；Western blot用兔抗人Anti-c-fos抗体、Anti-GAPDH，羊抗兔IgG(Santa Cruz Biotechnology公司)，ECL Western blot检测试剂盒(美国Santa Cruz公司)；免疫组化用兔抗人Anti-NK-1R抗体(Santa Cruz Biotechnology公司)，羊抗兔IgG(武汉博士德生物有限公司)，SABC免疫组化试剂盒。

二、实验方法

1. 细胞培养: 人支气管上皮细胞株(normal human bronchial epithelial cells, NHBEC)用10%胎牛血清的DMEM培养基(内含100 μ/ml青霉素和100 μg/ml链霉素)在37 ℃，5% CO2环境下培养，隔天换液，显微镜下查看细胞生长情况，当细胞长至基质的70%～80%表面面积时予以传代。将一部分细胞传代至六孔板中培养，剩下的细胞继续于50 cm3培养瓶内培养，当细胞长至基质的75%表面面积时进行干预试验。

2. 小干扰RNA(siRNA)的确定及合成: 通过Ambion公司提供的工具把特异针对人bcl xL基因的siRNA靶序列挑选出来,依据Tuschl设计siRNA的方法,选定siRNA序列如下：CTG CTT ACA CGT CTT CCT T，再使用沉默小干扰RNA合成试剂盒合成siRNA。实验操作按照试剂盒配套的工作手册进行。将体外转录合成的siRNA根据配套手册中的方法用紫外分光光度计定量，具体如下：①将少量siRNA样品和三羟甲基氨基甲烷乙二胺四乙酸电泳缓冲液按1︰25比例混合,随后用紫外分光光度计测量3次A260吸光度值,取平均数；②用公式siRNA浓度(μmol/L)=检测液A260×1 000/143计算siRNA浓度；③用荧光素标记，标记后，-70 ℃保存备用。

3. siRNA-脂质体转染： 以脂质体为载体，将沉默c-fos表达的特异性siRNA转染至NHBEC。采用0.3%胰酶消化对数生长期的细胞5 min后，DMEM培养液终止，以离心半径8 cm，1 000 r/min 离心10 min后弃上清，用适量PBS重悬细胞。通过自动细胞计数板计数来调整细胞浓度,将细胞悬液接种到新的培养瓶。在含10%胎牛血清DMEM中，37 ℃、5% CO2条件下,培养至18%～60%的融合率。把转染液配制的阳离子脂质体液分别与siRNA和dsRNA(非特异性)混合，使脂质体充分包裹，再加入细胞中转染20 h。

4. 荧光显微镜下观察转染效率: 将荧光素标记的siRNA转染至NHBEC内，当终浓度达到50 nmol/L时在避光条件下孵育48 h，随后用4 ℃ PBS洗涤3次，消化收集细胞，涂片，通过荧光显微镜查看绿色荧光细胞。

5. 实验分组及细胞干预: 细胞转染前1 d将细胞接种于6孔培养板，待细胞融合达50%～80%，将培养基换成无血清DMEM，并进行细胞转染。分组和干预如下：①对照组：加入500 μl无血清DMEM；②NGF组：加入100 ng/ml NGF干预60 min；③NGF+dsRNA组：加入非特异性dsRNA脂质体复合物500 μl预刺激后，再加入100 ng/ml NGF干预60 min后收获细胞；④NGF+siRNA组：加入500 μl c-fos siRNA脂质体复合物预刺激后，再加入100 ng/ml NGF干预60 min；⑤NGF+空白脂质体组：加入250 μl脂质体稀释液及25 μl无血清DMEM预刺激后，再加入100 ng /ml NGF干预60 min。每组3个复孔，显微镜下查看细胞形态变化。提取细胞总蛋白及RNA备用。

6. 应用western-blot测定细胞c-fos蛋白含量: 经上述分组干预后，将NHBEC刮下，以离心半径8 cm，1 000 r/min 离心10 min，随后将细胞移至EP管中。依照细胞数加裂解液裂解30 min(冰上进行)。4 ℃，以离心半径8 cm 13 000 r/min 离心20 min，取上清，用Bradford法检测蛋白质浓度。200 V电压下12%聚丙烯酰胺凝胶电泳1 h。100 V下电转移1 h，室温下5%脱脂牛奶封闭1 h。兔抗人c-fos抗体(1︰500稀释)孵育2 h，羊抗兔IgG(1︰1 000稀释)孵育1 h，配置ECL试剂盒工作液，显示蛋白条带，定影。显带的X线片在凝胶成像分析系统上分析，得出每条带的积分光密度(integral optical density, IOD)值。

7. RT-PCR方法测定细胞内NK-1R mRNA的表达: 用Trizol提取细胞总RNA，采用2 μl AMV逆转录酶反应体系将mRNA逆转录合成第一条互补DNA(cDNA)，再以此为模板进行RT-PCR反应操作。NK-1R引物序列：上游 5′-GGG ACT CCT CTG ACC GCT AC-3′；下游 5′-TCC AGG CGG CTG ACT TTG TA-3′，片段长度376 bp (753～1 128)。β-Actin引物序列：上游 5′-CCT TCC TGG GCA TGG AGT C-3′；下游 5′-GAG GAG CAA TGA TCT TGA TCT TC-3′，产物长度204 bp(867～1 070)。反应条件：95 ℃变性10 min；94 ℃ 30 s，70 ℃(-2 ℃/Cycle)30 s，72 ℃ 30 s，5个循环后，再94 ℃ 30 s，55 ℃(+0.2 ℃/Cycle)30 s，72 ℃ 30 s，共30个循环。

8. 间接法(免疫细胞化学)检测NK-1R在细胞内的表达： 细胞爬片，4%多聚甲醛固定20 min，0.01 mol/L PBS(pH 7.4)洗涤3次，5 min/次，然后加入1︰200一抗(Anti-NK-1R)，4 ℃过夜。PBS洗涤3次，5 min/次，滴加1︰100二抗，37 ℃温箱中孵育30 min。PBS洗涤3次，5 min/次，DAB显色试剂进行显色，蒸馏水洗涤3次，3 min/次，50 %缓冲甘油(将纯甘油与0.5 mol/L pH 9.5碳酸盐缓冲液按照1︰1体积比充分混匀)封片，200倍显微镜下观察。采用IPP6.0软件分析各组NK-1R的表达强度：以细胞胞浆或核中出现棕黄色产物为阳性反应。免疫组化结果采用定性分析[8]，阴性(-)：阳性细胞数<5 %；弱阳性(+)：阳性细胞数5%～25%；中度阳性(++)：阳性细胞数26%～50%；强阳性(+++)：阳性细胞数>50%。

三、统计学方法

结 果

一、细胞的一般情况

光镜下显示NHBEC转染各组试剂后，生长活跃，细胞形态正常。siRNA转染组以细胞内出现清晰的绿色荧光为转染成功，转染效率达到80%以上。

二、Western-blot测定细胞c-fos蛋白含量

与对照组相比，NGF干预后c-fos蛋白表达明显增加。如图中显示NGF组、NGF+dsRNA组、NGF+空白脂质体组的c-fos蛋白表达均明显强于对照组，P<0.01；与单纯NGF干预组相比，NGF+siRNA组的c-fos表达水平明显减少(P<0.01)。而dsRNA和脂质体组的c-fos表达量与单纯NGF干预组无明显差异，见图1，表1。

图1 Western-blot 半定量检测c-fos蛋白表达；注：1和2：NGF 组；3和4：NGF+siRNA组；5和6：对照组

表1 Western-blot 半定量检测c-fos蛋白表达

注：与对照相比aP<0.01；与NGF组相比bP<0.01

三、RT-PCR方法测定细胞内NK-1R mRNA的表达

与对照组比，NGF作用1 h后，NK-1R mRNA表达水平显著增高，图中可见NGF组、NGF+dsRNA组、NGF+空白脂质体组的NK-1R mRNA表达均明显强于对照组(P<0.01)。c-fos siRNA可抑制NGF诱导NHBEC表达NK-1RmRNA，即NGF+siRNA组的 NK-1RmRNA 表达水平要明显低于 NGF 干预组(P<0.01)。而dsRNA和脂质体均无此抑制作用，见图2。

图3 免疫细胞化学法观察NK-1R表达；注：A: 对照组 (SABC×200)；B: NGF组 (SABC×200)；C：NGF+空白脂质体组(SABC×200)；D：NGF+siRNA组 (SABC×200)；E：NGF+dsRNA组 (SABC×200)

图2 RT-PCR半定量检测NK-1R mRNA表达；注：与对照相比*P<0.01；与NGF组相比#P<0.01

四、间接法(免疫细胞化学)检测NK-1R在细胞内的表达

NK-1R阳性产物为棕黄色颗粒，以胞浆表达为主。对照组无明显的NK-1R表达，为阴性反应，NGF组及NGF+空白脂质体组为强阳性反应，NGF+非特异dsRNA组呈阳性反应，而NGF+siRNA组表达明显减少，为弱阳性反应。提示NGF可以刺激NHBEC表达NK-1R，而c-fos siRNA可以抑制NGF对NHBEC内NK-1R表达的刺激作用，见图3。

讨 论

支气管哮喘是肺部最常见的慢性炎症性疾病，其发病机制与气道炎症，气道高反应性及气道重塑相关[9-12]。支配气道的感觉神经及其相关营养因子与气道炎症的形成密切相关[13-15]。目前已知与哮喘密切相关的感觉神经肽有P物质(substance P, SP)、神经激肽A(neurokinin A, NKA)、神经激肽B(neurokinin B, NKB)等[16-17]，它们通过与相应的受体结合而促发气道神经源性炎症[18]。

既往研究证实，哮喘大鼠肺组织中NGF明显增多，并参与气道源性炎症[19]。在NGF的作用下，SP及其主要受体 NK-1R的表达也显著增多。在本研究中，NGF对NK-1R表达的促进作用再次得到证实。而在对大鼠纹状体内源性镇痛机制的研究中发现，c-fos与NK-1R的表达量呈正相关 ,依据以上线索，我们推测NGF可能是通过活化MAPK通路中的c-fos信号分子，进而促进支气管上皮细胞中NK-1R的表达的，并构建siRNA阻断c-fos表达，从反方向对上述假说加以验证。

本研究观察到，经NGF干预后，NHBEC中c-fos蛋白的表达较对照组明显增多，这与我们之前的研究结果基本一致[6]，同时RT-PCR和免疫细胞化学结果提示NGF可以促进NK-1R在支气管上皮细胞中的表达，这说明NGF不但能通过促进P物质的释放[20]，还能刺激其受体在支气管上皮细胞的表达来参与气道神经源性炎症。为明确NGF是否通过c-fos蛋白来调控NK-1R的表达，我们用siRNA沉默c-fos基因表达，结果表明，当c-fos基因未阻断时，NGF作用后NK-1R表达明显增强，而用siRNA阻断c-fos基因后，NGF对NK-1R表达的促进作用受到抑制。提示NGF对NK-1R表达的促进作用是通过c-fos蛋白实现的。已知c-fos是Ras/MAPK通路中的重要下游蛋白，因此NGF对NK-1R表达的促进作用很可能是通过活化Ras/MAPK/c-fos信号通路来实现的。

综上所述，本研究发现NGF可通过c-fos促进支气管上皮细胞中NK-1R的表达，进而介导哮喘神经源性炎症。应用RNAi技术可以减少NGF诱导的人支气管上皮细胞c-fos蛋白及NK-1R的表达。本研究结论为哮喘的机制研究和治疗靶点提供了新的线索。

1 Tan H, Pan P, Zhang L, et al. Nerve growth factor promotes expression of costimulatory molecules and release of cytokines in dendritic cells involved in Th2 response through LPS-induced p75NTR[J]. J Asthma, 2016, 53(10): 989-998.

2 Shimko MJ, Zaccone EJ, Thompson JA, et al. Nerve growth factor reduces amiloride-sensitive Na+transport in human airway epithelial cells[J]. Physiol Rep, 2014, 2(7): e12073.

3 魏兵, 尚云晓, 李淼, 等. 孟鲁司特对幼年哮喘气道重塑大鼠感觉神经肽受体NK1R表达的影响[J]. 中国当代儿科杂志, 2013, 15(4): 298-301.

4 Hu C, Wedde-Beer K, Auais A, et al. Nerve growth factor and nerve growth factor receptors in respiratory syncytial virus-infected lungs[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2002, 283(2): L494-L502.

5 汤渝玲, 胡成平, 冯俊涛, 等. 人支气管上皮细胞神经生长因子的信号传导通路[J]. 暨南大学学报(自然科学与医学版), 2010, 31(6): 582-587.

6 汤渝玲, 胡成平, 冯俊涛, 等. 神经生长因子调控哮喘神经源性炎症Ras-MAPK信号转导通路[J]. 中南大学学报(医学版), 2006, 31(3): 319-325.

7 Nakamura Y, Izumi H, Shimizu T, et al. Volume transmission of substance P in striatum induced by intraplantar formalin injection attenuates nociceptive responses via activation of the neurokinin 1 receptor[J]. J Pharmacol Sci, 2013, 121(4): 257-271.

8 虞跃跃, 崔建美, 李双, 等. 针刺对支气管哮喘大鼠肺组织c-fos蛋白表达的影响[J]. 中国中西医结合杂志, 2016, 36(9): 1124-1127.

9 李超, 方圆, 李志奎. 哮喘-COPD重叠综合症相关性疾病166例分析[J/CD]. 中华肺部疾病杂志(电子版), 2015, 8(6): 704-709.

10 潘亦林, 朱燕亭, 李满祥. 支气管哮喘气道重塑的研究进展[J/CD]. 中华肺部疾病杂志(电子版), 2015, 8(6): 773-776.

11 Guihua X, Shuyin L, Jinliang G, et al. Naringin protects ovalbumin- induced airway inflammation in a mouse model of asthma[J]. Inflammation, 2016, 39(2): 891-899.

12 Holgate ST, Wenzel S, Postma D S, et al. Asthma[J]. Nat Rev Dis Primers, 2015, 1: 15025.

13 Luo Y L, Li PB, Zhang CC, et al. Effects of four antitussives on airway neurogenic inflammation in a guinea pig model of chronic cough induced by cigarette smoke exposure[J]. Inflamm Res, 2013, 62(12): 1053-1061.

14 佘巍巍, 曾锦荣, 王昌明, 等. 神经生长因子介导神经源性气道炎症机制探讨[J]. 重庆医学, 2011, (2): 108-110.

15 Yang H, Li S. Transient receptor potential ankyrin 1 (TRPA1) channel and neurogenic inflammation in pathogenesis of asthma[J]. Med Sci Monit, 2016, 22: 2917-2923.

16 韦杰. 气道神经源性炎症介质在感染后慢性咳嗽发病机制中的作用[J]. 白求恩军医学院学报, 2012, 10(5): 373-374.

17 沈若冰, 余小萍, 何铭晟. 蝉芩颗粒对大鼠气道神经源性炎症的作用机制研究[J]. 四川中医, 2016, 34(1): 51-56.

18 Ramalho R, Almeida J, Beltrao M, et al. Substance P antagonist improves both obesity and asthma in a mouse model[J]. Allergy, 2013, 68(1): 48-54.

19 Chen YL, Huang HY, Lee CC, et al. Small interfering RNA targeting nerve growth factor alleviates allergic airway hyperresponsiveness[J]. Mol Ther Nucleic Acids, 2014, 3: e158.

20 朱锦琪, 胡成平, 冯俊涛, 等. 神经生长因子、白血病抑制因子调控哮喘神经源性炎症机制的研究[J]. 中华结核与呼吸杂志, 2006, 29(6): 22-26.

(本文编辑：张大春)

李志芳，秦岭，贺若曦，等. 神经生长因子通过c-fos促进支气管上皮细胞NK-1R表达[J/CD]. 中华肺部疾病杂志(电子版)， 2017， 10(2)： 146-150.

Nerve growth factor stimulates the expressions of NK-1R in bronchial epithelial cells via c-fos

LiZhifang1,QinLing1,HeRuoxi1,HuXinyue1,TangYuling2,HuChengping1,FengJuntao1.

1DepartmentofRespiratoryMedicine,XiangyaHospital,CentralSouthUniversity,Changsha410008,China;2DepartmentofRespiratoryMedicine,theFirstHospitalofChangsha,Changsha410005,China

HuChengping,Email：huchengp28@126.com

Objective To investigate whether the effect of nerve growth factor on NK-1R expression of bronchial epithelial cells is via c-fos. Methods Human bronchial epithelial cells (NHBEC) were taken as the research object, the c-fos siRNA was transected into cells through the positive ion fat plastid, and then the NGF intervention was carried on. The control group, NGF intervention group, NGF+c-fos siRNA group, NGF+ liposomes group, NGF+non-specific dsRNA group were decided. After trans-infection for 12 h and then intervention for 60min, the protein expression of c-fos was detected by western-blot. The protein and mRNA expression of NK-1R was determined by RT-PCR and immune cell chemical definite quality respectively. Results Compared with the control group, the expressions of c-fos protein, NK-1R protein and NK-1RmRNA were significantly increased in NGF group (P<0.01); compared with NGF group, the expressions of c-fos protein, NK-1R protein and NK-1RmRNA were significantly reduced in NGF+c-fos siRNA group (P<0.01), NGF intervention group, NGF+liposomes group, NGF+ non-specific dsRNA group had no significant difference in the expression of them. Conclusion NGF stimulates the expressions of NK-1R in bronchial epithelial cells via c-fos. and then mediate neurogenic inflammation of asthma. RNAi could reduced the of c-fos protein and NK-1R induced by NGF in human bronchial epithelial cells.

Bronchial asthma; Nerve growth factor; C-fos; NK-1R

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2017.02.007

国家自然科学基金资助项目(81400022,81270080)

410008 长沙，中南大学湘雅医院呼吸科1410005 长沙，长沙市第一医院呼吸科2

胡成平，Email：huchengp28@126.com

R563

A

2017-01-17)