任冰霜雷艳孔旭辉王水良路君黄梁浒

LC3基因沉默对小鼠肝癌细胞Heap1-6凋亡影响的研究

任冰霜1，2雷艳1孔旭辉1，2王水良1路君1黄梁浒1

目的 建立小鼠LC3基因沉默的Heap1-6稳定表达细胞系，探讨其对衣霉素诱导的肝癌细胞凋亡的影响。方法 设计并合成一段针对小鼠LC3基因的shRNA及不针对任何基因的shRNA作为阴性对照，将它们退火后连接构建重组载体，转化扩增及酶切鉴定之后将重组质粒与病毒包装、包膜质粒共同转染293T，收集病毒上清转染Heap1-6细胞，嘌呤霉素筛选10 d，获得稳定的细胞株。以导入LC3基因shRNA的Heap1-6为实验组（Heap1-6 shLC3），以导入shcoo2的Heap1-6为对照组（Heap1-6 shctrl）。衣霉素处理实验组和对照组的细胞，Western Blot检测LC3Ⅱ、c-Caspase3、Caspase9蛋白的表达，流式细胞术检测细胞凋亡。Western Blot条带灰度值之间两组比较采用独立样本的t检验。结果 成功构建了pLKO.1-shLC3重组慢病毒载体，与野生型的Heap1-6相比，LC3基因沉默之后，LC3Ⅱ蛋白表达水平降低了62.9﹪（P ＜ 0.01）；野生型的Heap1-6和LC3基因沉默之后的Heap1-6 shLC3都经Tm处理12 h之后，后者LC3Ⅱ蛋白表达水平降低了58.6﹪（P ＜ 0.01）。与对照组Heap1-6 shctrl相比，衣霉素作用12 h后实验组Heap1-6 shLC3 c-Caspase3增加了37.7﹪（P = 0.007），Caspase9增加了37.1﹪（P = 0.023））；衣霉素作用24 h后shLC3组c-Caspase3增加了12.6﹪（P = 0.04）， Caspase9增加了14.3﹪（P = 0.043）。药物干预12 h和24 h后，Heap1-6 shLC3组比对照组Heap1-6 shcoo2凋亡比例分别增加22.8﹪和18.6﹪。结论 成功建立小鼠LC3基因沉默的Heap1-6稳定表达细胞系，LC3基因沉默促进衣霉素诱导的小鼠肝癌细胞Heap1-6的凋亡。

基因； shRNA； 肝肿瘤； 细胞凋亡

自噬是真核生物体内一种高度保守的动态过程，能应对各种应激反应，例如：低氧、营养物质缺乏等发生时，自噬降解细胞内的蛋白质或者受损细胞器，并且循环利用降解产物[1-2]。然而，自噬在肿瘤发生发展的不同阶段发挥的作用不尽相同，研究表明，肝癌的发生、发展和侵袭转移都与自噬密切相关[3-5]。……