李新玉 吴永贵

·综述·

自噬在糖尿病肾脏疾病发病和治疗中的意义

李新玉 吴永贵

糖尿病肾脏疾病(diabetic kidney disease,DKD)是糖尿病最严重的并发症之一，也是导致终末期肾病的主要原因[1]。DKD与糖尿病患者的病死率密切相关，能够直接阻止DKD进展的治疗措施至关重要。DKD的临床症状包括尿蛋白排泄增加、肾小球滤过率受损、肾脏功能进行性下降，最终导致终末期肾衰竭。高糖环境介导下细胞内代谢状态的改变，包括晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGEs)堆积、蛋白激酶C激活以及氧化应激是DKD的主要发病机制[2]。目前，DKD的治疗主要集中于患者血糖和血压的控制，尤其是通过抑制肾素-血管紧张素系统来减少甚至逆转蛋白尿的进展。临床研究表明,一些DKD患者的蛋白尿症状是可以逆转或部分逆转的[3]，然而这些治疗对一些难治性蛋白尿如肾病综合征患者是没有效的。因此，我们需要扩展对DKD发病机制的认识以寻找新的治疗措施。

自噬是进化上高度保守的维持细胞内稳态的代谢过程，即细胞内的蛋白质和受损细胞器通过溶酶体途径降解[4]。近年来，自噬作为细胞生物学功能上的重要通路而获得广泛关注，在衰老、免疫、炎症、肿瘤及神经退行性疾病等生理和病理过程中均发挥着重要作用[5]。自噬在肾脏中的作用也受到众多研究者的关注，在肾脏的衰老和病变(如急性和慢性肾损伤，肾小球和小管间质疾病，遗传性肾脏疾病等)过程中发挥重要的保护作用[6]。同时，也有众多研究表明DKD的发病机制与自噬活动的受损有一定联系，自噬在DKD中受到抑制，使得肾脏更易受到糖尿病带来的损伤[7]。本文总结了现有实验研究发现的自噬在DKD中的作用，并进一步深入探讨自噬途径作为治疗DKD的新策略的潜在可能。

一、自噬

“自噬”一词来源于希腊语“自我消化”，其在细胞内主要有两种功能：一是在营养缺乏的条件下循环利用细胞内的能量物质；二是在不同的应激环境下移除有害的蛋白质产物和受损的细胞器[8]。在过去十几年间，关于细胞自噬机制的基础研究已经为其在人类健康和疾病中的重要作用提供了证据[9]。

自噬的形成过程起始于双层膜结构的小囊泡即吞噬泡的形成。吞噬泡延长，吞噬一部分细胞内物质，延长并融合封闭，形成自噬体。自噬体接着与溶酶体融合，形成自噬溶酶体，其内包含的物质被降解并循环利用。自噬体的形成包括四个关键步骤：起始，成核，延长，关闭[8]。每一个过程都受自噬相关基因(autophagy related gene,Atg)的精细调控。自噬体起始于Unc-51样蛋白激酶复合体1(Unc-51-like kinase,Ulk1)的激活。自噬泡的成核依赖磷脂酰肌醇-3激酶3族(phosphatidylinasitol 3-kinase,PI3K)复合体，包含人空泡分选蛋白34(human vacuolar protein sorting 34,hVps34),Beclin1和Atg14[10]。自噬体的延长包含了两个泛素样连接系统：Atg12和微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)。细胞质中的LC3-Ⅰ通过两个连续性泛素化反应，与磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine,PE)结合，形成了位于自噬体膜表面的LC3-Ⅱ。因此，LC3-Ⅱ的形成象征着自噬体形成，是细胞和动物实验中发生自噬的生物化学标志[8]。随后自噬体与溶酶体结合形成自噬溶酶体，其内物质被溶酶体酶降解。泛素样结合蛋白p62/Sequestosome 1(SQSTM1)通过LC3介导定位在自噬体上，由自噬溶酶体系统降解。所以，在自噬缺陷细胞中可以观察到p62的聚集[11]。

二、糖尿病环境下足细胞自噬

足细胞，即肾小球上皮细胞，主要作用是维持肾小球滤过屏障的稳定。足细胞足突功能失调及足细胞的死亡是DKD产生大量蛋白尿的原因[12]。自噬在维持足细胞功能的过程中发挥着重要的作用。足细胞是具有高度特异性的终末分化且不能增殖的细胞，即使在无应激的正常环境下，自噬水平也十分活跃，这表明足细胞需要一个相当高的基础水平的自噬活动以维持细胞稳态[5]。

有研究表明足细胞自噬与DKD的发病机制有关。Fang等[13]在链脲霉素(streptozotocin,STZ)诱导的糖尿病小鼠和体外高糖培养环境下的足细胞中均观察到自噬活动受损现象，自噬受损进一步造成足细胞的损伤。使用自噬抑制剂抑制足细胞的基础自噬水平之后，足细胞膜蛋白的表达减少，滤过功能下降，加重了蛋白的漏出。Tagawa等[14]的研究表明，与对照组相比，足细胞特异性敲除自噬基因Atg5的2型糖尿病小鼠产生了大量蛋白尿，小管间质受损更严重，足细胞结构和功能被破坏，从而更加准确地说明了自噬在DKD中的保护作用。因此，高糖环境破坏了足细胞的保护性自噬活动，导致足细胞的功能紊乱，加重肾功能损伤。(图1)

注:糖尿病环境抑制了足细胞的基础水平自噬和近端小管细胞的应激诱导自噬,导致大量蛋白尿和近端小管细胞损伤图1 糖尿病环境下足细胞和近端小管细胞的自噬示意图

三、糖尿病环境下近端小管细胞自噬

在糖尿病患者中，蛋白尿介导的近端小管损伤，会加速肾脏功能的下降，是肾功能预后不良的重要因素[15]。自噬在近端小管与在足细胞中的生理功能有很大差别。正常环境下，近端小管细胞的基础自噬水平很低，但处在应激状态下时，其自噬水平明显提高。实验证明在缺血再灌注损伤以及抗肿瘤药物等造成的急性肾功能损伤中，近端小管的自噬水平增加，表明自噬功能的激活具有保护肾脏的作用[16]。而在包括DKD在内的许多蛋白尿性肾病中，流入近端肾小管腔内的尿蛋白增加，造成了肾毒性物质应激环境，从而激活近端小管细胞的自噬活动以增加尿蛋白的重吸收。所以无论急性或慢性肾毒性物质应激时，近端小管细胞自噬的增加都具有肾脏保护功能。

研究表明近端小管细胞的自噬活动在高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型和Wistar肥胖大鼠模型中均被明显被抑制，导致p62蛋白和受损的线粒体在近端小管细胞大量堆积，加重了肾组织损伤[17-18]。同时近端小管的自噬不足也在2型糖尿病患者肾活检标本中得到进一步证实[17]。所以糖尿病介导的自噬损伤可能是造成近端小管细胞受损的原因，因此恢复其自噬功能可能成为治疗DKD大量蛋白尿患者的新方向。(图1)

四、DKD中自噬营养相关调节机制

1.mTORC1通路 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体(mammalian target of rapamycin complex,mTORC)由mTORC1和mTORC2组成，是高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶复合体，具有调控细胞生长，增殖，分化等多种功能。在细胞内氨基酸含量和胰岛素水平充足的情况下，mTORC1通过直接磷酸化，抑制Ulk1复合体的活动，负向调控自噬[19]。

实验研究证实mTORC1通路在人类和动物模型的1型和2型糖尿病中均被激活[20]。Inoki等[21]通过足细胞特异性敲除mTORC1上游的负向调节子Tsc1，在非糖尿病小鼠足细胞中激活mTORC1，观察到了肾小球基底膜增厚，足细胞丢失以及蛋白尿等一系列与DKD相似的症状。与之相反，足细胞特异性敲除mTORC1的重要结构Raptor，在基因水平上减少mTORC1的表达则会减轻DKD的症状。这表明mTORC1通路激活对自噬的抑制在DKD的发病机制中发挥着重要的作用。

2.AMPK通路 腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK)通过细胞内AMP/ATP的比例来感应细胞内能量变化。与mTORC1通路相反，在营养缺乏的情况下，ATP浓度下降，细胞内AMPK通路则被激活，正向调节自噬。AMPK通过两条互相独立的途径激活自噬：①抑制mTORC1的活动；②直接调控Ulk1的磷酸化[22]。

Ding等[23]观察到在STZ诱导的1型糖尿病模型小鼠的肾小球和肾小管中，AMPK的磷酸化及激动均受抑制，给予AMPK激动剂之后，AMPK的抑制被转变，蛋白尿减少，肾功能下降得到改善。这表明AMPK通路的抑制阻止了自噬并促进了DKD的发展。因此，AMPK的激活可能是在DN自噬活动的修复中的重要靶点。

3.SIRT1通路 沉默信息调节因子1(silenti information regulator 1,Sirt1)是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)依赖的脱乙酰基酶，是另一条正向调节自噬的营养相关信号通路。然而，目前对于Sirt1介导的自噬诱导通路的了解并不多。细胞能量缺乏时，Sirt1通路在NAD/NADH比例增加时被激活。Sirt1一方面在饥饿诱导的自噬激活下直接脱去一些Atg蛋白的乙酰基[24]。另一方面，Sirt1还能催化叉头蛋白O3a(Forkhead box O3a,FOXO3a)的脱乙酰基反应，FOXO3a介导了Bnip3/BCL2基因转录水平的上调，从而激活了Beclin-1依赖的自噬启动[25]。

Hasegawa等[26]使用Sirt1基因过表达和Sirt1基因敲除的小鼠模型证明DKD中Sirt1的缺失与足细胞和近端小管细胞损伤的发病机制有关。因此，与AMPK通路的作用相似，Sirt1通路在肾脏中发挥着保护性作用，在DKD中，Sirt1通路被抑制，自噬水平下调，从而导致了相关的肾脏损伤。这些发现表明Sirt1通路也是一个可能的DKD治疗靶点。

除了以上营养相关的自噬经典途径之外，高糖环境中的AGEs、过氧化物应激，内质网应激，低氧等因素引起的自噬受损也在DKD的发病机制中发挥着重要的作用[27]。

五、以自噬为靶向的DKD治疗新策略

各项研究已经证明自噬活动的受损是DKD的发病机制。因此，以调节自噬活动为靶向的物质，可能成为治疗DKD的潜在新策略。前文已经提及自噬的调控与细胞营养相关信号通路如mTORC1、AMPK以及Sirt1通路有关，那么能够调控这些信号通路的药物就可能成为治疗DKD的新方法。

1.雷帕霉素 作为肾脏疾病的免疫抑制剂而被广泛应用的雷帕霉素是经典的mTORC1抑制剂，目前已有许多研究致力于探索其作为自噬激动剂在DKD中的作用。Xiao等[28]的研究发现，给予STZ诱导的1型糖尿病小鼠腹腔注射雷帕霉素，能够减轻小鼠肾脏重量及体质量，减少尿白蛋白排泄，改善足细胞损伤，同时足细胞LC3表达增加，自噬体数目增多。表明雷帕霉素能够激活自噬，减轻糖尿病小鼠肾脏损伤，延缓DKD进展。然而，过量的mTORC1抑制也能造成肾小球足细胞的功能失调[29]。因此，雷帕霉素以及其他mTORC1抑制剂治疗是一把双刃剑，其对于所有的糖尿病患者是否安全有效需要更多的实验研究进一步证明。

2.白藜芦醇和二甲双胍 AMPK和Sirt1通路都是自噬的正向调节通路，AMPK和Sirt1通路的激动剂如：白藜芦醇、二甲双胍、阿卡的新等已经应用于DKD自噬激活的研究。

白藜芦醇是在多种植物如葡萄、浆果、花生等中发现的自然多酚类复合物，众多研究已经表明其在糖尿病心血管并发症和肾脏疾病中发挥潜在的保护作用[30]。白藜芦醇通过AMPK和Sirt1通路激活自噬，同时也可作为活性氧类代谢产物的清除剂发挥抗氧化作用。Ma L等[31]给予STZ诱导的糖尿病小鼠模型长达四个月的白藜芦醇之后，明显降低了其血清肌酐、尿白蛋白及糖化血红蛋白水平。同时Sirt1基因、自噬相关蛋白和基因的表达均明显增加。与此相反，给予体外低氧环境下培养的Sirt1基因敲除的近端小管细胞白藜芦醇并不能诱发其自噬活动。从而更加准确地说明了白藜芦醇通过调控自噬活动发挥肾脏保护作用。目前，白藜芦醇已经被应用于成人减肥治疗安全性的临床试验研究[32]。

二甲双胍是一种双胍类衍生物，是目前2型糖尿病患者的一线口服用药。作为AMPK通路的激动剂，除了降低血糖作用之外，目前已有许多研究表明二甲双胍通过激活AMPK通路，在糖尿病肾病和其他慢性肾脏病中发挥保护肾功能的治疗作用[33]。Allouch 等[34]的研究表明二甲双胍通过增加体外高白蛋白培养环境下小鼠肾脏近端小管细胞的AMPK磷酸化激活其自噬活动，减少近端小管细胞的凋亡和向间质细胞的转化，发挥其抗蛋白尿毒性。因此，二甲双胍可能作为潜在的自噬激动剂，发挥肾脏保护作用，延缓DKD进展，然而其确切作用机制仍有待进一步研究证实。

3.饮食限制 自噬在营养缺乏的环境下能够被激活以适应长期的饥饿环境。因此，过去十几年间，许多研究者已经发现饮食摄入控制介导的自噬激活具有延长哺乳动物寿命、抗衰老的功能[35]。Kitada等[18]的研究表明给予Wistar肥胖大鼠饮食限制24周之后，实验组大鼠白蛋白排泄率明显减少、肌酐清除率和 Sirt1 表达明显增加，同时近端小管细胞的自噬活动增加，肾脏损伤得到改善。这表明饮食限制可以调控Sirt1通路，增加自噬活性，减轻糖尿病大鼠肾脏炎症反应，延缓病变进展。因此，基于饮食限制的激活哺乳动物细胞自噬的疗法，可能成为延缓DKD进展的新的治疗方式。

然而，目前有关自噬保护性作用的研究都是基于动物实验，仍缺少证据表明这些发现可以应用在人类临床实验之中。而且所有干预自噬活动的生物制剂均缺乏特异性，涵盖了除调节自噬之外的一系列其他生物功能。除此之外，自噬的过度激活也能诱发细胞凋亡[36]，所以在自噬的调控过程中还存在着一个肾脏保护作用和诱发凋亡之间的关键界限。总之，目前在DKD中仍缺少以自噬为靶向，安全有效的干预治疗措施。因此我们需要发现一种特异的、肾脏选择性的自噬调控剂。目前，有研究发现了一种Tat-Beclin融合蛋白能够通过其他信号通路无副作用地选择性诱导自噬，从而提供了一种新的治疗策略[37]。

六、小结

总之，自噬在移除聚集的蛋白质和受损细胞器中发挥着重要的作用，提高了细胞的生存和维持组织的稳态。自噬功能的失调参与了DKD的发病机制，以自噬为靶点的激活和修复自噬活动具有肾脏保护作用。因此自噬可能成为治疗DKD的潜在新策略。将来的研究需要进一步揭示自噬在DKD肾小球和小管损伤中更加精确的功能调控作用，增强我们对于自噬在肾脏功能中的理解以指导DKD的治疗。

[1] Tuttle KR, Bakris GL, Bilous RW, et al. Diabetic kidney disease: a report from an ADA Consensus Conference[J]. Diabetes Care, 2014, 37(10): 2864-2883.

[2] Turkmen K. Inflammation, oxidative stress, apoptosis, and autophagy in diabetes mellitus and diabetic kidney disease: the Four Horsemen of the Apocalypse[J]. Int Urol Nephrol, 2016. DOI: 10.1007/s11255-016-1488-4.

[3] Yokoyama H, Araki S, Honjo J, et al. Association between remission of macroalbuminuria and preservation of renal function in patients with type 2 diabetes with overt proteinuria[J]. Diabetes Care, 2013, 36(10): 3227-3233.

[4] Boya P, Reggiori F, Codogno P. Emerging regulation and functions of autophagy[J]. Nat Cell Biol, 2013, 15(7): 713-720.

[5] Ding Y, Choi ME. Autophagy in diabetic nephropathy[J]. J Endocrinol, 2015, 224(1): R15-30.

[6] Wang Z, Choi ME. Autophagy in kidney health and disease[J]. Antioxid Redox Signal, 2014, 20(3): 519-537.

[7] Lenoir O, Tharaux PL, Huber TB. Autophagy in kidney disease and aging: lessons from rodent models[J]. Kidney Int, 2016. DOI: 10.1016/j.kint.2016.04.014.

[8] Mizushima N, Komatsu M. Autophagy: renovation of cells and tissues[J]. Cell, 2011, 147(4): 728-741.

[9] Choi AM, Ryter SW, Levine B. Autophagy in human health and disease[J]. N Engl J Med, 2013, 368(19): 1845-1846.

[10]Ravikumar B, Sarkar S, Davies JE, et al. Regulation of mammalian autophagy in physiology and pathophysiology[J]. Physiol Rev, 2010, 90(4): 1383-1435.

[11]Komatsu M, Waguri S, Koike M, et al. Homeostatic levels of p62 control cytoplasmic inclusion body formation in autophagy-deficient mice[J]. Cell, 2007, 131(6): 1149-1163.

[12]Brinkkoetter PT, Ising C, Benzing T. The role of the podocyte in albumin filtration[J]. Nat Rev Nephrol, 2013, 9(6): 328-336.

[13]Fang L, Zhou Y, Cao H, et al. Autophagy attenuates diabetic glomerular damage through protection of hyperglycemia-induced podocyte injury[J]. PLoS One, 2013, 8(4): e60546.

[14]Tagawa A, Yasuda M, Kume S, et al. Impaired Podocyte Autophagy Exacerbates Proteinuria in Diabetic Nephropathy[J]. Diabetes, 2016, 65(3): 755-767.

[15]Abbate M, Zoja C, Remuzzi G. How does proteinuria cause progressive renal damage?[J]. J Am Soc Nephrol, 2006, 17(11): 2974-2984.

[16]Kaushal GP, Shah SV. Autophagy in acute kidney injury[J]. Kidney Int, 2016, 89(4): 779-791.

[17]Yamahara K, Kume S, Koya D, et al. Obesity-mediated autophagy insufficiency exacerbates proteinuria-induced tubulointerstitial lesions[J]. J Am Soc Nephrol, 2013, 24(11): 1769-1781.

[18]Kitada M, Takeda A, Nagai T, et al. Dietary restriction ameliorates diabetic nephropathy through anti-inflammatory effects and regulation of the autophagy via restoration of Sirt1 in diabetic Wistar fatty (fa/fa) rats: a model of type 2 diabetes[J]. Exp Diabetes Res, 2011: 908185. doi: 10.1155/2011/908185.

[19]Hosokawa N, Hara T, Kaizuka T, et al. Nutrient-dependent mTORC1 association with the ULK1-Atg13-FIP200 complex required for autophagy[J]. Mol Biol Cell, 2009, 20(7): 1981-1991.

[20]Kume S, Koya D, Uzu T, et al. Role of nutrient-sensing signals in the pathogenesis of diabetic nephropathy[J]. Biomed Res Int, 2014: 315494. doi: 10.1155/2014/315494.

[21]Inoki K, Mori H, Wang J, et al. mTORC1 activation in podocytes is a critical step in the development of diabetic nephropathy in mice[J]. J Clin Invest, 2011, 121(6): 2181-2196.

[22]Kume S, Koya D. Autophagy: A Novel Therapeutic Target for Diabetic Nephropathy[J]. Diabetes Metab J, 2015, 39(6): 451-460.

[23]Ding DF, You N, Wu XM, et al. Resveratrol attenuates renal hypertrophy in early-stage diabetes by activating AMPK[J]. Am J Nephrol, 2010, 31(4): 363-374.

[24]Lee IH, Cao L, Mostoslavsky R, et al. A role for the NAD-dependent deacetylase Sirt1 in the regulation of autophagy[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008, 105(9): 3374-3379.

[25]Kume S, Uzu T, Horiike K, et al. Calorie restriction enhances cell adaptation to hypoxia through Sirt1-dependent mitochondrial autophagy in mouse aged kidney[J]. J Clin Invest, 2010, 120(4): 1043-1055.

[26]Hasegawa K, Wakino S, Simic P, et al. Renal tubular Sirt1 attenuates diabetic albuminuria by epigenetically suppressing Claudin-1 overexpression in podocytes[J]. Nat Med, 2013, 19(11): 1496-1504.

[27]Liu N, Shi Y, Zhuang S. Autophagy in Chronic Kidney Diseases[J]. Kidney Dis (Basel), 2016, 2(1): 37-45.

[28]Xiao T, Guan X, Nie L, et al. Rapamycin promotes podocyte autophagy and ameliorates renal injury in diabetic mice[J]. Mol Cell Biochem, 2014, 394(1-2): 145-154.

[29]Pallet N, Legendre C. Adverse events associated with mTOR inhibitors[J]. Expert Opin Drug Saf, 2013, 12(2): 177-186.

[30]Albertoni G, Schor N. Resveratrol plays important role in protective mechanisms in renal disease-mini-review[J]. J Bras Nefrol, 2015, 37(1): 106-114.

[31]Ma L, Fu R, Duan Z, et al. Sirt1 is essential for resveratrol enhancement of hypoxia-induced autophagy in the type 2 diabetic nephropathy rat[J]. Pathol Res Pract, 2016, 212(4): 310-318.

[32]Anton SD, Embry C, Marsiske M, et al. Safety and metabolic outcomes of resveratrol supplementation in older adults: results of a twelve-week, placebo-controlled pilot study[J]. Exp Gerontol, 2014, 57: 181-187.

[33]Ravindran S, Kuruvilla V, Wilbur K, et al. Nephroprotective Effects of Metformin in Diabetic Nephropathy[J]. J Cell Physiol, 2017, 232(4): 731-742.

[34]Allouch S, Munusamy S. Metformin Attenuates Albumin-induced Alterations in Renal Tubular Cells In Vitro[J]. J Cell Physiol, 2017. doi: 10.1002/jcp.25838.

[35]Kapahi P, Kaeberlein M, Hansen M. Dietary restriction and lifespan: Lessons from invertebrate models[J]. Ageing Res Rev, 2016. doi: 10.1016/j.arr.2016.12.005.

[36]De Rechter S, Decuypere JP, Ivanova E, et al. Autophagy in renal diseases[J]. Pediatr Nephrol, 2016, 31(5): 737-752.

[37]Shoji-Kawata S, Sumpter R, Leveno M, et al. Identification of a candidate therapeutic autophagy-inducing peptide[J]. Nature, 2013, 494(7436): 201-206.

10.3969/j.issn.1671-2390.2017.04.012

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230022 合肥，安徽医科大学第一附属医院肾内科

吴永贵，E-mail:wuyonggui@medmail.com.cn

2016-10-12

2017-01-05)