杨襄蓉 魏春山 刘 婵 张晓辉 罗奇智

胃癌中lncRNA BC002811表达与微血管密度和淋巴结转移的关系及其临床意义

杨襄蓉 魏春山 刘 婵 张晓辉 罗奇智

目的 探讨lncRNA(long non-coding RNA，长链非编码RNA)BC002811在胃癌中的表达与微血管密度和淋巴结转移及胃癌发生发展及预后的关系。方法 纳入行胃癌手术切除患者的病例样本共计48例，对这48例胃癌样本采用qPCR检测lncRNA BC002811的相对表达量及检测微血管密度(MVD)参数，并与淋巴结转移等预后情况进行相关性分析。结果 lncRNA BC002811相对表达量与患者的一般资料如年龄、性别以及肿瘤的特征如大小、发病的部位、侵袭深度、分期及分化程度、是否远处转移等并不存在相关性(P>0.05)；而淋巴受累方面，淋巴受累组的lncRNA BC002811相对表达量明显上调(P<0.05)，而无淋巴受累组的相对表达量与正常组相比差异无统计学意义(P>0.05)。lncRNA BC002811表达水平与MVD差异表达具有相关性。结论 lncRNA BC002811相对表达量水平与胃癌的淋巴结转移及预后有一定的相关性，但还需进一步系统研究。

胃癌；预后；lncRNA BC002811；微血管密度；淋巴结转移；相关性

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:706～709)

胃癌(gastric cancer) 是1种发生于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，好发于中、老年人，发病高峰年龄在50～80岁，并呈逐年年轻化趋势。在世界范围内，胃癌发病率在全部恶性肿瘤中居第4位，死亡率高居第2位，并且每年新发病例超过100万[1]。我国属胃癌的高发地区，且多数患者患病后初次就诊已经伴有广泛的淋巴结转移或者远端的转移，失去根治手术的机会，因此，寻找新的生物学靶标用于胃癌的癌变监测和干预成为胃癌防治迫切需要解决的问题[2-3]。近年来研究发现，在乳腺癌、肝癌、胆管癌、胃癌等多种肿瘤中lncRNA在调控肿瘤血管的生成中具有重要的作用，研究发现1种新型的lncRNA BC002811在胃癌组织以及4种胃癌细胞中均呈明显的表达上调，其作为促癌基因发挥肿瘤生长调控作用[4-5]。本研究收集胃癌患者lncRNA BC002811的表达情况、淋巴结转移及MVD参数资料，通过分析lncRNA BC002811与微血管新生及模式的演变规律，进一步探讨lncRNA BC002811相对表达量水平与胃癌发展与预后之间的关系。

1 材料与方法

1.1 病例的收集

纳入我院普外科2012年1月至2015年1月行胃癌手术切除的48例患者病例样本，通过病理诊断均确诊为原发性胃癌，纳入研究的所有患者均为初诊的患者，且在术前未进行任何放疗、化疗及分子靶向治疗等。48例中男性25例，女性23例，年龄43～76岁，平均年龄为(62.35±10.54)岁。在术中取材之后，肿瘤的位置以病理组织报告为标准，将样本立即放置入液氮罐中保存，转入-80 ℃冰箱长期保存，在实验前取出，提取胃癌组织的RNA，同时进行病理学的监测，对胃癌组织的病理学进行分型，肿瘤的浸润程度按照国际抗癌联盟标准分类[4]，淋巴分化以及转移采用的国际WHO的诊断标准[5]进行分析判断，对所有手术治疗的患者从出院到死亡进行随访观察，随访的时间以每月1次。同时纳入健康人群23例作为对照组，所有受试者签订知情同意书。

1.2 实验试剂和仪器

试剂：DEPC(美国Invitroge公司)，Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG(上海碧云天生物)，PCR试剂盒、TaqMan RNA试剂盒(美国Sigma)，TaqMix(东盛生物公司)，RNA提取试剂盒(美国Santa Cruz公司)，异丙醇、乙醇、氯仿(上海硕盟生物)。

仪器：紫外分光光度仪(德国BiofugeStratos)，-80 ℃～4 ℃冰箱(日本松下)，PCR仪(澳大利亚Rotor-gene)，高速冷冻离心机(Beckman Coulter 公司)。

1.3 RNA提取及qPCR检测

对48例胃癌组织采用RNA提取试剂盒进行RNA提取，采用TaqMan RNA试剂盒检测lncRNA BC002811的相对表达量。采用RNU6作为内参进行校正。对lncRNA BC002811的表达水平采用二步法进行检测，第一步是通过茎环引物来合成互补DNA，再通过RNA的逆转录系统对10 ng RNA进行逆转了反应体系进行反应，在PCR管加入10 μl的逆转录缓冲液，总的RNA浓度调整到2 ng/μl，最后加入5 μl的逆转录引物，在冰上混匀之后反应5 min，行梯度变形反应，反应条件为94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、60 s，72 ℃、7 min，依次递减；第二步采用Platinum SYBR Green qPCR的反应体系，该体体系具体形式：Taqman RNA的特异性引物与2×的 PCR Taqman Universal混合液相互混合之后通过逆转录PCR反应，再加入5 μl cDNA到RNA的去酶的水当中，将体积扩增至20 μl，通过循环反应94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、60 s，72 ℃、7 min递减的扩张40个循环之后，对实验结果进行分析，采用荧光实时定量反应，按照PCR操作说明，Ct的检测值应当在20～32之外的需要进行第2次检测。应用△Ct=CtlncRNA BC002811-CtRNU6的计算公式计算lncRNA BC002811的相对表达量。

1.4 MVD的检测

资深病理专家对病理切片复核确认，利用相应的存档组织蜡块进行血管染色，标记微血管密度，记录观察微血管的生长模式。

1.5 统计学检测

所有纳入分析研究的数据采用SPSS 21.0的统计软件建立数据库，将lncRNA BC002811表达水平分为2组，小于平均值为低表达组，大于平均值作为高表达组。lncRNA BC002811的表达水平高低与发病相关因素分析以逐步回归法筛选有统计学意义的变量，对临床病理因素之间的风险情况采用logistic回归分析，组间比较用方差分析，组间均数比较采用t检验，组间率的比较用卡方检验，两两比较采用LSD检验。应用Kruskal-wallis H检验进行多组间数据的比较。

2 结果

2.1 lncRNA BC002811的相对表达量与临床病理特征之间的相关性

48例胃癌组织的lncRNA BC002811的相对表达量为1.462，95%CI为0.363～0.595。表达量低于平均值的有21例，高于平均值的有27例，lncRNA BC002811相对表达量与患者的一般资料如年龄、性别以及肿瘤的特征如大小、发病的部位、侵袭深度，分期及分化程度、是否远处转移等并不存在相关性(P>0.05)；而淋巴受累方面，淋巴受累组的lncRNA BC002811相对表达量明显上调(P<0.05)，而无淋巴受累组的相对表达量与正常组相比差异无统计学意义(P>0.05)，lncRNA BC002811相对表达量明显上调与淋巴结受累转移的风险有关，见表1。

2.2 lncRNA BC002811相对表达量的高低与淋巴结转移风险之间的关系

采用logistic回归分析lncRNA BC002811相对表达量的高低与淋巴结转移风险之间的相关性，lncRNA BC002811相对表达量的上升会增加胃癌淋巴结转移的风险性，通过调整风险其OR=5.21，95%CI为1.26～16.54，P=0.02，见表2。

表1 lncRNA BC002811的相对表达量与临床病理特征之间的相关性±s)

表2 lncRNA BC002811相对表达量的高低与淋巴结转移风险之间的关系

2.3 胃癌组织中lncRNA BC002811的mRNA表达水平与MVD的相关性

lncRNA BC002811 mRNA表达水平与MVD差异表达具有相关性(γs=4.86，P=0.01)，见表3。

表3 胃癌组织中lncRNA BC002811 mRNA的表达与MVD的关系

3 讨论

近年来，尽管不断有与胃癌相关的癌基因、抑癌基因以及相关肿瘤信号通路等被发现和证实，但其发病机制尚未完全清楚。目前，对胃癌相关分子及其调控、干预机制的研究是胃癌研究的热点。胃癌早期症状多缺乏特异性，早期病例仅占胃癌手术病例的10%～20%，大约2/3的患者在确诊时已经处于中晚期或已出现淋巴结、血行转移，其5年生存率仅为20%～30%[6-8]。胃镜检查是诊断胃癌的“金标准”，但胃镜检查过程中患者不适反应多，依从性差，限制了其作为胃癌筛查的应用。上消化道钡餐透视、CT和磁共振等影像学检查已广泛应用于胃癌诊断，但早期胃癌和癌前病变的影像学表现常缺乏特异性，故影像学检查在发现早期胃癌及微小病灶方面有一定的局限性[9]。而CEA、CA72-4和CA19-9等传统的肿瘤标志物多在胃癌晚期才明显升高，其诊断胃癌的阳性率较低，多在40%以下[10-11]。因此，寻找新的生物学靶标用于胃癌的癌变监测和干预成为胃癌防治迫切需要解决的问题。

肿瘤微血管新生是其浸润和远处转移的前提条件[12]，目前评价肿瘤血管生成的标准是测定肿瘤微血管密度(MVD)。而肿瘤微血管存在多种不同的模式，势必对肿瘤的进展及预后产生影响，但是有关微血管模式与肿瘤进展以及脉管内癌栓、局部肿瘤浸润等高危因素以及预后的关系鲜见报道[13]。人类基因组转录大量的RNA分子，除了经典的蛋白编码基因的mRNA外，人们发现了很多短链非编码RNA(microRNA和smallRNA，长度<200 bp)和长链非编码 RNA(lncRNA，长度>200 bp)分子[14]。lncRNA是哺乳动物转录组的重要成分，但是其功能目前并不十分清楚[15]。最近研究发现 lncRNA在细胞发育过程中起重要作用，其调节异常与人类疾病密切相关。研究发现，前列腺特异性的lncRNA PCA3 可作为一种前列腺癌的早期诊断标志物，其比目前临床上已广泛使用的前列腺特异性抗原PSA具有更高的灵敏度和特异性[16]。因此，我们以通过lncRNA芯片筛选得到的具有潜在致癌活性的lncRNA BC002811作为切入点，研究其功能和调控机制，为胃癌的诊断和治疗提供新的标志物和靶标，具有非常重要的理论和现实意义，同时也将为该病的诊断和治疗带来显著的社会效益。

研究表明肿瘤细胞中lncRNA BC002811的水平上调，具有促进肿瘤生长的作用[17]。本研究通过分析lncRNA BC002811在胃癌中的表达与微血管密度和淋巴结转移及胃癌发生发展及预后的关系，为胃癌的抗血管生成治疗研究提供理论依据。结果显示，lncRNA BC002811相对表达量与患者的一般资料如年龄、性别、以及肿瘤的特征如大小、发病的部位、侵袭深度，肿瘤的分期及分化程度、是否远处转移等并不存在相关性；而淋巴受累方面，淋巴受累组的lncRNA BC002811相对表达量明显上调，lncRNA BC002811相对表达量明显上调与淋巴结受累转移的风险有关，同时发现lncRNA BC002811表达水平与MVD差异表达具有相关性，对早期胃癌的诊断具有一定的作用。

综上所述，我们发现lncRNA BC002811在胃癌中表达上调与淋巴结转移有着密切的相关性，提示lncRNA BC002811可能与胃癌的转移侵袭等影响预后的因素有关，该分子差异性表达推测可能是胃癌早期的潜在靶点，但是本研究不足的是病例数还相对较少，lncRNA BC002811在胃癌中的作用机制和靶基因生物学预测和阐明有待于进一步研究。

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(编辑：甘 艳)

Relationship between Expression of lncRNA BC002811 and Microvessel Density and Lymph Node Metastasis in Gastric Cancer and Its Clinical Significance

YANGXiangrong,WEIChunshan,LIUChan,etal.

LonggangDistrictSecondPeople'sHospital,Shenzhen,518112

Objective To investigate the relationship between expression of lncRNA BC002811 and microvessel density,lymph node metastasis,development and prognosis in gastric cancer.Methods 48 cases of gastric cancer treated with surgical resection was selected,and qPCR was used to detect relative expression of lncRNA BC002811 (MVD)and microvessel density,and correlation analysis of lymph node metastasis and prognosis were conducted.Results lncRNA BC002811 relative expression amount and general information of patients such as age,gender,and tumor characteristics such as size,site of disease,depth of invasion,stage and tumor differentiation,metastasis had no correlation (P>0.05);and lymphatic involvement group lncRNA BC002811 relative expression levels significantly increased (P<0.05),relative expression of non lymph node involvement group and the normal group had no significant difference (P>0.05),lncRNA BC002811 expression and MVD differential expression were correlated.Conclusion lncRNA BC002811 relative expression levels and the amount of lymph node metastasis and prognosis of gastric cancer have a certain relevance,but need to be further studied.

Gastric cancer;Prognosis;lncRNA BC002811;Microvessel density;Lymph node metastasis;Correlation

深圳市科技研发资金(编号：JCYJ20150402092653980)

518112 深圳市龙岗区第二人民医院(杨襄蓉，刘 婵，罗奇智)；518034 深圳市中医院(魏春山)；518034 深圳市中医院中医药研究所细胞分子学实验室(张晓辉)

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.05.003

R735.2

A

1001-5930(2017)05-0706-04

2016-10-09

2017-03-27)