李云南，刘青

（1.山西省水产育种养殖科学实验中心，山西 清徐 030400；2.山西农业大学动物科技学院，山西 太谷 030801）

新型苯扎溴铵对克氏原螯虾急性毒性的研究

李云南1，刘青2

（1.山西省水产育种养殖科学实验中心，山西 清徐 030400；2.山西农业大学动物科技学院，山西 太谷 030801）

本实验采用静水式实验方法，克氏原螯虾为受实动物，研究新型苯扎溴铵对克氏原螯虾的急性毒性，结果表明16℃时，新型苯扎溴铵对克氏原螯虾的24、48、96 h半数致死浓度分别为14.0、9.0、7.0 μL/L，安全浓度为0.7 μL/L。

固着纤毛虫病；苯扎溴铵；急性毒性

克氏原螯虾的养殖过程中，养殖池塘的塘底和养殖水体常因环境变异而滋生细菌、病毒以及附生生物导致虾病发生。新型苯扎溴铵作为虾养殖过程中的疾病治疗及水体消毒剂使用[1]。本实验就这种药物在养殖过程中的作用效果及使用的安全剂量做一探讨。

随着养殖水环境及药物滥用的发生，常引发各种疾病，而固着纤毛虫病是虾蟹养殖过程中的主要疾病，其由累枝虫、聚缩虫、钟形虫等附着类纤毛虫寄生在虾眼鳃及体表上引发的一类寄生虫疾病。目前这类治疗这类疾病的药物不少，作为最早开始使用的药物，孔雀石绿对固着纤毛虫有很好的杀灭效果，但因其高毒性、用药后生物体内残留时间长以及“三致”等毒副作用。早在2002年已被国家列入禁用药清单。此外有硫酸铵、硫酸铜、高锰酸钾、甲醛或戊二醛及代森类制剂还有传统中草药制剂，但这些药物有的成本过高，有的毒副作用大，有的还是禁用药[2]。因此新型药物研发很有必要，新型苯扎溴铵具有高效、低毒等特点，主要通过其表面强效的活性作用改变病原体细胞膜的通透性来影响病原体的新陈代谢，另外也可引起蛋白质变性起到抗菌杀虫的作用[3]。因此在虾蟹养殖中用于治疗固着纤毛虫病及对虾肌肉坏死症，又可以作为消毒剂抑制塘中有害细菌。但作为新型药物在投放市场前需要了解其用药安全问题。

1 材料及与方法

1.1 材料

1.1.1 实验对象克氏原螯虾购自当地水产贸易市场，体长（8.9±0.6）cm，体质量（31.5±1.5）g/尾，体态正常、规格整齐、无病无伤。在实验室内用曝气48 h以上的脱氯自来水驯养1周，每天正常投饲和换水，及时剔除摄食和运动不正常的个体，每天记录病死率，当病死率稳定在5%以下时方可用于实验，在实验结束前一天停止投饲，正常换水，确保实验动物处于空肠状态。

1.1.2 实验药品新型苯扎溴铵瓶装液体由山西益鑫泰生物科技有限公司提供。

1.1.3 实验条件暂养及实验期间的实验用水是经过48 h以上曝气处理的脱氯自来水，平均水温（18±1）℃，pH值7.5，溶氧量4.5～5.5 μL/L，实验采用自然光照。实验容器是半透明水族箱，在使用之前用高锰酸钾溶液清洗浸泡消毒，清洗晾干。实验之前用设计浓度实验药品浸泡容器24 h，减少实验中容器对药品的吸附，最后向每个容器中加入40 L实验用水并加入新配的相应浓度药品，从低浓度组向高浓度组依次各放入相同数量、规格一致、体质健康的实验动物。

1.2 实验方法

采用静水实验法[4]对实验动物进行急性毒性实验，探讨新型苯扎溴铵对克氏原螯虾的安全浓度，需要通过96 h预实验得出全数致死下限浓度和全部存活上限浓度。

根据药物的预实验结果在浓度间分别按等差和等比设计4个浓度梯度，用蒸馏水溶解实验药品并按照设计浓度梯度配置成便于取用的高浓度母液。临用时，用移液枪移取定量母液稀释成最高浓度组的设计浓度，然后按照等比浓度梯度稀释法稀释得到剩下四个浓度的药液。然后向各实验容器中加入40 L经48 h曝气自来水，再对应加入配好药液，从低浓度组向高浓度组依次放入规格一致、活泼健康的实验动物并设平行组和不加药的空白对照组。每24 h换一次水，换水量为20 L，每次换水前按浓度要求配置好，换水时从低浓度向高浓度进行。在实验过程中需要每天观察记录实验动物的反常行为、外观变化、中毒症状、死亡等现象。中毒后，多次刺激后无反应，放置在清水中30 min后仍无反应则判定为死亡，及时捞出死亡个体记录死亡数量计算病死率。根据改良寇氏法计算苯扎溴铵对克氏原螯虾的安全浓度。

1.2.1 预实验将药品稀释或溶解配置成便于计算取用的高浓度母液，按照等比浓度梯度稀释法配置药液获得5个浓度梯度，从各试管中移取一定体积药液按标记加入实验容器中形成5个浓度组，实验设一个不加药物的对照组。新型苯扎溴铵实验组每个浓度组加入11尾规格一致、肢体健全、健康的克氏原螯虾。观察96 h，记录24、48、72、96 h病死率，得到克氏原螯虾对新型苯扎溴铵耐受浓度和100%致死的药液浓度。

1.2.2 实验前准备实验药品需要提前配制好便于计算取用的高浓度母液。容器需要进行标记编号，上面有实验药品种类、浓度、开始时间。先用高锰酸钾溶液消毒、再用对应浓度的药品浸泡24 h。用清洗消毒的水族箱盛满自来水，48 h不间断增氧曝气脱氯用作实验用水。虾在实验前暂养一周，驯养期间正常投饲、换水，实验前48 h停止喂食以排空肠道，在实验前对实验动物挑选、测量记录体长体质量。新型苯扎溴铵组每个浓度投放6尾克氏原螯虾。

1.2.3 实验开始新型苯扎溴铵实验药液配置采用等比稀释法，先取用一定量高浓度母液稀释得到6号浓度组的加药浓度。通过等比稀释获得新型苯扎溴铵的其余5个浓度的药液。配好的药液用移液管量取定量药液加入对应实验容器，配置好实验组溶液，然后按照低浓度到高浓度的方向放入实验动物。同一浓度设平行组，实验设不加药的对照组。实验时间不投饲，每24 h换1/2的水，并加药保持原有浓度不变。实验开始后每24 h观察记录一次水温、pH及实验动物活动情况、中毒反应、死亡情况。发现死亡个体及时记录、捞出。

1.3 数据处理

数据采用Excel表格进行统计，根据实验动物死亡情况列表得出每个浓度的平均病死率，用改良寇氏法公式（1）计算半数致死浓度[5]。据此按公式（2）[6]计算安全浓度。

式中：Xm为最大剂量的对数；i为相邻两组对数量之差数；ΣPi为各组病死率之和。

2 实验结果

2.1 中毒症状

实验中，向32 μL/L浓度组中放入试验虾后，出现中毒初期症状，虾活动剧烈，快速移动，此时用玻璃棒刺激会出现正常的抵御反应；药物作用一段时间后，活动能力减弱，螯足附肢收缩、僵硬、附肢出现抽搐，有的能爬行，行进非常缓慢，且动作僵硬不连贯，有的侧躺、仰卧，失去运动能力，用玻璃棒刺激尾部无任何抵御反应；24 h内全部死亡，死亡时螯足、附肢僵硬呈收缩紧抱状态，正常缺氧致死的虾肢脚呈伸展瘫痪状态。8 μL/L和16 μL/L浓度组出现中毒症状，活动能力减弱，濒死的个体侧躺、仰卧，失去运动能力，在48～96 h期间大规模出现虾的回避反应，侧身附着在箱壁露出水面。

2.2 结果

新型苯扎溴铵对克氏原螯虾的急性毒性实验结果见表1。

在新型苯扎溴铵中克氏原螯虾24、48、72、96 h的LC50分别为14.0、9.0、8.4、7.0 μL/L。根据经验公式SC=96 h LC50×0.1得到安全浓度SC为0.7 μL/L，如表2。LC50随药物作用时间的延长越来越小，对克氏原螯虾的急性毒性作用越来越大。急性毒性随药作用时间延长而增加呈正相关变化，在相同作用时间下病死率随水中药物浓度升高而递增。同其他药物急性毒性效果相同，随浓度升高、作用时间延长而增加。整个过程2 μL/L组未出现死亡，与对照组相同。随着药物浓度的增大，实验虾开始出现死亡现象，在24 h内32 μL/L浓度组的病死率为100%，24 h内4 μL/L浓度组病死率为0，随着药物作用时间的延长，72 h开始出现死亡，病死率为27.3%，正是由于药物在体内的富集超过一定程度引起的。

表1 新型苯扎溴铵对克氏原螯虾的急性毒性

表2 新型苯扎溴铵的半数致死浓度LC50及安全浓度SC

以96 h半致死质量浓度为评判对象，依据国家环境保护局给出的新化学药品对鱼类急性毒性的危害等级标准（见表3）可知新型苯扎溴铵制剂属于高毒药物。

3 分析和讨论

表3 新化学药品对鱼类急性毒性危害等级标准

根据新型溴铵产品说明，其治疗固着纤毛虫病如蟹居江氏伪钟虫的泼洒浓度0.35 μL/L，施用浓度低于其对克氏原螯虾的安全浓度0.7 μL/L。因此在一定浓度范围施用是不会对克氏原螯虾造成影响的。但是新型苯扎溴铵作为高毒药物，在施用时应控制好用量，避免施用时全池泼洒，而是采用短时间浸浴进行疾病的防治。其中成虾对苯扎溴铵安全浓度高于幼虾安全浓度，致毒能力幼虾大于成虾[1，7]，因此对幼龄阶段的个体要注意施药用量。新型苯扎溴铵的主要成分是苯扎溴铵，苯扎溴铵是消毒液的主要成分，为广谱杀菌剂，对金黄色葡萄球菌具有良好的杀菌效果，对大肠杆菌、枯草杆菌以及源弧菌均有抑制作用，并且随时间的延长易分解，因此该药也可用于放养前池壁及水体的消毒[1，8-10]。

[1]余伟楠，陆宏达，朱磊，等.苯扎溴铵对几种淡水水生生物的急性毒性[J].广东农业科学，2014（15）：111-120.

[2]尹伦甫，陈昌福.虾、蟹纤毛虫病的现状与防治方法[J].科学养鱼，2008（10）：91-93.

[3]王艳萍.苯扎溴铵消毒液杀菌试验观察[J].安徽农业科学，2014，2（20）：6530-6531.

[4]邱郁春.水污染鱼类毒性实验方法[M].北京：环境技术科学出版社，1992：50-95.

[5]郑繁生，郑海涛，卢飞麟.几种常见药物对斑点叉尾鮰的毒性试验[J].广西水产科技，2007（03）：25-28.

[6]姜礼燔.鱼药的安全浓度评价方法[J].中国医院药学杂志，1995（6）：27.

[7]刘青.两种渔药对克氏原螯虾的急性毒性研究[J].水产科技情报，2012，39（4）：198-200.

[8]李来好，吴燕燕，刁石强，等.苯扎溴铵复方消毒液在水产品加工厂的应用[J].江海洋大学学报，2006，6（1）：24-28.

[9]姚小娟，王元，赵姝，等.三氯异氰脲酸和苯扎溴铵对海水养殖源弧菌的抑菌和杀菌效果[J].南方水产科学，2015（11）：33-38.

[10]曲建全，曲静，宋晓红，等.0.2%苯扎溴铵溶液消毒效果验证[J].食品与药品，2000，12（11）：430-433.

Model of benzalkonium bromide on Procambarus clarkii study on acute toxicity

Li Yunnan1.Liu Qing2
（1.Aquaculture Breeding Science Experimental Center of Shanxi Province，Qingxun 030400，China；2.College of Animal Science and Technology,Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

The experiment stuided with routine bidogical toxicity method under the condition of indoor with still water.The results showed that：on 16℃the median tolerance concentration at 24 h，48 h，72 h and 96 h of Model of Benzalkonium bromide on Procambarus clarkii were 14.0，9.0，7.0 μL/L，the safe concentration was 0.7 μL/L.

fixing ciliate；benzalkonium bromide；acute toxicity

S948

A

1004-2091（2017）04-0031-04

10.3969/j.issn.1004-2091.2017.04.007

2016-06-30）

山西省水利厅事业发展类项目（2014JSCW340）、山西农业大学横向项目（2013HX102）

李云南（1984-），男，助理工程师，研究方向：水产养殖疾病防治.E-mail：632416015@qq.com

刘青（1980-），男，讲师.E-mail:liuqing_sxau@126.com