夏萍

（重庆师范大学 生命科学学院，重庆 401331）

纤毛虫隶属于原生生物界，是一类形态多样、数量众多、分布极为广泛的单细胞真核生物。经历了漫长的演化形成了其独特的接合生殖方式、双态核型及多样性的形态结构，成为细胞生物学、生理学等多个学科的模型生物[1]。同时，纤毛虫在微生物食物网中也扮演着重要的角色，在物质循环、能量流动中发挥了枢纽作用；此外，营寄生或栖生的纤毛虫常对水产养殖造成危害，且某些水体中纤毛虫大量繁殖可能危害水环境[2]。因此，纤毛虫的相关研究一直是国际基础生物学研究的焦点。但纤毛虫因个体微小、多数类群难以培养和单体难以分离等特点，阻碍了研究者们进一步对其多样性的充分认识。

当前高通量测序技术方兴未艾，其具有测序数据量大、准确度高等特点，已经逐渐运用到环境纤毛虫多样性的研究中，包括不同深度的海水、沉积物、土壤和宿主等环境。本文对高通量测序技术进行概述，并综述了目前高通量测序技术在纤毛虫研究中的应用，以期促进纤毛虫多样性研究的进一步发展。

1 高通量测序技术概述

1977 年，Sanger 测序诞生并得到广泛运用，随后由于研究者们对大规模测序需求的逐渐增加，基因测序技术得到不断发展。2005 年开始，基于焦磷酸测序原理的GS FLX Titanium 测序平台、基于边合成边测序原理的Illμmina 测序和ABI 公司的SOLiD 测序等相继出现，拉开了第二代测序技术的帷幕，即高通量测序技术。相比于传统测序，高通量测序技术显著降低了多样本、大规模测序的测序成本，且可以直接反馈样本中各OTU（Operational Taxonomic Unit）的丰度，但较短的测序长度一直是二代测序的痛点[3]。此后，单分子实时测序的出现，标志着第三代测序技术时代的开始。相比于前两代测序技术，测序速度和序列长度都有了较大的提升，同时也避免了PCR 扩增所产生的偏差，但有研究显示其目前存在较高的错误率。因此，目前二代测序技术仍是大规模测序的主流。

2 高通量测序技术在水域生态系统纤毛虫研究中的应用

地球水资源丰富，其表面2/3 被水所覆盖，其中包括江河湖泊等淡水资源，也包括大洋和海水等咸水资源。广阔的水环境养育了多种多样的生物，其中纤毛虫是水域生态系统的重要组成部分。目前，对纤毛虫多样性的研究主要集中在海洋生态系统中。研究表明，不同海洋生态系统中存在较高的真核生物多样性，而纤毛虫是其中的主要类群[4]。近年来，高通量测序技术的介入，极大地提高了人们对水域生态系统中纤毛虫多样性的认识。2016 年，Gimmler 等[5]在真光层水体中筛选得到1 274 个纤毛虫的OTU，其中存在许多未被描述的纤毛虫物种，多样性远高于传统形态学研究及第一代测序所获得的纤毛虫物种数。研究表明，在海水水域和南海南部浅海海域中的浮游纤毛虫中，舞毛亚纲和寡毛亚纲物种丰度占据绝对优势[6]。台湾海峡中，旋毛纲是浮游纤毛虫的优势类群；纤毛虫多样性与海水的营养程度呈正相关，营养程度越高的海水具有更高的纤毛虫多样性，浅层海水中纤毛虫多样性高于深层，浅层海水中纤毛虫的多样性随着深度的增加呈现先增加后降低的趋势，且不同深度纤毛虫的群落组成存在显著差异。底栖纤毛虫中前口纲等为优势类群；在沉积物中，形态学研究表明前口纲和裂口纲为优势类群，但高通量测序结果显示浮游类纤毛虫占据优势，后有研究表明这可能是沉积物中富集了水体中的浮游纤毛虫的DNA，且沉积物中的纤毛虫多样性高于自然水体[7]，因此沉积物中纤毛虫的物种组成及多样性分析还有待进一步的研究。

3 高通量测序技术在土壤生态系统纤毛虫研究中的应用

通过检测土壤中纤毛虫等原生生物的群落变化，可以监测人类土地利用活动对土地的影响，从而促进生态系统的可持续发展。纤毛虫也被认为是理想的土地利用变化和土壤环境压力的生物指标。1913 年，Martin 等[8]证明了原生动物在土壤生态系统中是一个较为独立的结构，随后，土壤中纤毛虫的研究逐渐受到研究者们的重视，并主要通过形态学特征及分子系统发育等对纤毛虫个体进行研究。目前，中欧地区的土壤类群是基于形态学研究中描述最为全面的，有研究者对中欧某些地区采样并进行高通量测序，结果表明能精确匹配的OTUs 较少，且形态学数据库与分子数据库存在明显的差异[9]。国内也逐渐将高通量测序技术应用于土壤纤毛虫的研究中，有研究通过研究土壤中纤毛虫的群落变化评估退耕还林、退牧还草、施加化肥等对土壤质量的影响，从而判断上述措施的可行性；也有研究对西藏那曲、西藏拉萨、甘肃庆阳、甘肃兰州等地区的纤毛虫群落特征进行描述，表明土壤中纤毛虫的物种组成、群落构成能够客观地描述不同生境的特征，显示了高通量测序技术在群落结构变化研究中的优势。

4 高通量测序技术在寄生或共栖生纤毛虫研究中的应用

许多生物的消化道栖息着大量微生物，包括原虫、细菌和真菌等，其中原虫主要是纤毛虫。纤毛虫的群落构成受宿主的食物种类、分布地区和年龄等因素的影响。研究消化道内纤毛虫的物种组成变化及其与宿主之间复杂的关系也是营养学、病害学等的研究热点之一。有部分研究通过高通量测序技术对黑山羊瘤胃中的纤毛虫种群结构进行分析，同时分析不同的饲粮、饲料添加剂等对瘤胃内纤毛虫群落的影响[10]。此外，通过高通量测序技术对不同中性洗涤纤维（NDF）饲粮水平下塔里木马鹿的瘤胃内的原虫进行研究，结果显示内毛属和多甲属是其消化道内的主要属，原虫的活力与数量会受到饲粮水平的影响，但对原虫多样性无显著影响。Kittelmann 等[11]发现反刍动物瘤胃内的原虫与某些厌氧真菌呈现明显的负相关关系。除上述研究以外，国内外还通过高通量测序技术对山羊、奶牛、湖羊、绵羊以及驼鹿等动物进行研究，涉及瘤胃内原虫与其宿主的种属、饲粮、瘤胃内容物的关系，原虫与肠道菌群的相关性等，其应用极为广泛。将分子生物学的技术手段与动物营养学相结合，有助于增加对动物整体的认识，为消化道内原虫的研究提供新的思路。

5 结语

高通量测序技术在微生物领域应用广泛，但在纤毛虫等原生动物研究中应用较少。已有的研究显出示高通量测序技术在纤毛虫的研究中具有巨大的潜力，但目前的研究主要针对水域生态系统相关类群，罕有对寄生或栖生的纤毛虫和土壤中自由生活的纤毛虫的多样性进行研究，同时也极少有研究者研究纤毛虫物种组成与其影响因素。因此，采用高通量测序技术对更多生境类群进行研究，将有助于进一步增加对纤毛虫的认识。此外，目前仍存在大量的纤毛虫物种未被描述，形态学数据库与分子数据库并不匹配，增加形态数据、深入挖掘已有的高通量测序所得的短序列信息也可能是纤毛虫研究发展的一个方向。