胡光源，林 琳，汪地强，王 莉

(贵州茅台酒股份有限公司技术中心，贵州 仁怀 564501)

应用多级液液微萃取结合气质联用定量白酒中的角鲨烯

胡光源，林 琳，汪地强，王 莉*

(贵州茅台酒股份有限公司技术中心，贵州 仁怀 564501)

将多级液液微萃取与气相色谱-质谱联用技术相结合建立了白酒中微量角鲨烯的快速定量方法。将白酒稀释后，用戊烷-乙醚混合溶剂(1∶3，体积比)进行多级微萃取，有机相浓缩后气质联用分析。结果显示，角鲨烯在0.62～159.88 μg/L范围内具有良好的线性关系，相关系数为0.995 5，角鲨烯的检出限为0.17 μg/L，当加标浓度为2,20,40 μg/L时回收率分别为78.1%,85.0%和103.5%，相对标准偏差(RSD)分别为12.1%,8.9%和7.0%。该方法具有简便快速、准确灵敏、萃取效率高、有机溶剂消耗少等优点，适合白酒中痕量角鲨烯的定量分析。

角鲨烯；白酒；多级液液微萃取；气相色谱-质谱联用；定量分析

白酒独特的固态多微酿造及固态蒸馏工艺赋予了其丰富的呈香呈味物质和生物活性成分。与世界上其它蒸馏酒相比，中国白酒的呈香呈味物质最为丰富[1]。然而，白酒作为传统发酵食品，其生物活性相关成分的研究较少。目前，已检测到白酒中的生物活性成分有四甲基吡嗪[2-3]、萜烯类物质[4-5]、酚类物质[6]、5-羟甲基糠醛[1]、愈创木酚[7]、脂肽类化合物等[8]。

图1 角鲨烯的化学结构Fig.1 Chemical structrue of squalene

角鲨烯(Squalene)，又称鲨烯，三十碳六烯，其化学名为2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯，分子式为C30H50，分子量为410，结构如图1所示。角鲨烯为含有6个双键的三萜化合物，其结构高度不饱和使之具有抗氧化性。Reddy等[9-10]发现角鲨烯具有抗癌、抗肿瘤、抗氧化等生物活性，能减缓皮肤老化进程，减少身体的劳累感、加强免疫系统能力等功效，是一种典型且实用的生物活性物质。角鲨烯主要存在于植物[11-12]、鲨鱼肝油[9]、保健食品和大米中[13-14]，关于白酒中角鲨烯的研究尚未见报道。由于白酒固态蒸馏的特殊性，其中存在少量的难挥发性物质，而角鲨烯难挥发，且在白酒中极其微量，分析检测难度大。预实验发现，采用直接进样、顶空进样、固相微萃取、搅拌棒吸附萃取均不能实现其在白酒中的定性、定量分析。液液萃取可以较大程度地富集待检样品中的痕量物质，但其操作步骤繁琐，使用有机溶剂量大，待检样品需求量大，检测成本较高，定量检测效率较低，不宜作为定量方法。而分散液液微萃取避免了液液萃取的一些缺点，在食品分析领域应用日益广泛[15-16]，但其需使用一定量的有毒分散剂。

本文依据液液萃取的原理，通过降低酒样中乙醇浓度，优化萃取剂的种类、比例和使用体积，优化不同萃取级数，同时采用涡旋振荡提高萃取效率，氮吹浓缩提高目标物的浓度，减少了酒样用量及有机溶剂用量，建立了白酒中角鲨烯的快速定量方法，旨在更加深入的挖掘传统白酒中生物活性成分。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

角鲨烯(98%，美国Sigma公司)；乙醚、戊烷、氯化钠(分析纯，上海国药集团)。

气相色谱-质谱联用仪7890A-5975C(Agilent公司,USA)；毛细管色谱柱：DB-FFAP(J&W Scientific,Folsom,CA,USA),DB-5MS(Agilent Technology,Santa Clara,CA,USA)。

酒样：以不同香型不同品牌的白酒为研究对象，包括12个酱香型白酒、12个浓香型白酒、8个清香型白酒及9个其它香型白酒。

1.2 实验方法

1.2.1 多级液液微萃取 将10 mL待测白酒样品稀释至一定酒度，取稀释后的酒样于样品瓶中，加适量NaCl过饱和，再加一定量的萃取剂，迅速旋紧瓶盖，涡旋振荡1 min，静置分层后，吸取有机相0.5 mL于液相小瓶中；萃取后的样品再加一定量的萃取剂进行下一级的液液微萃取，以此类推。根据角鲨烯的性质，结合液液微萃取的原理，分别对酒样乙醇浓度、萃取剂种类及比例、萃取剂体积、萃取级数以及色谱柱参数等进行优化。

1.2.2 仪器条件 气相色谱(GC)条件：气相色谱进样口温度为280 ℃，毛细管色谱柱为DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，载气为He，流速1 mL/min；气相色谱的升温条件为：160 ℃不保持，以10 ℃/min升温至280 ℃，恒温5 min，共17 min；MS条件：EI电离源，离子源温度230 ℃，电子能量70 eV，采用为SIM模式定量，定量离子为69。

质谱(MS)条件：电子电离源(Electron ionization,EI)，电子轰击能量70 eV，离子源温度230 ℃，扫描范围35.00～500.00 u，质谱谱库为 NIST 14a.L。

1.2.3 角鲨烯的定性与定量分析 采用 NIST 14a.L Database(Agilent Technologies Inc.)中标准谱图和实物标准品比对，对目标物进行定性分析。

标准曲线的绘制：吸取一定浓度的角鲨烯溶液加入到模拟白酒中，并用等体积的模拟白酒进行逐级稀释后，配制成一系列浓度梯度的标准溶液，依次对每一浓度梯度的标准溶液按优化后的方法进行多级萃取，获得有机相，浓缩后进行GC-MS分析，并以角鲨烯不同系列浓度为纵坐标，对应的峰面积为横坐标建立标准曲线。

酒样测定：将待测酒样按优化后的方法进行多级萃取，获得有机相，吸取1 μL有机相进GC-MS分析。

1.2.4 回收率的测定 将不同浓度的角鲨烯加入模拟酒样中，测定不同浓度的加标回收率。测定实物酒样中角鲨烯的回收率时，每种香型白酒选择1个代表酒样进行实物加标回收率验证，每个酒样平行测定3次，计算不同香型白酒中角鲨烯的加标回收率。

2 结果与讨论

2.1 多级液液微萃取方法的建立

2.1.1 酒样中乙醇浓度的影响 白酒中的乙醇含量高，乙醇对目标物的萃取干扰大。直接加有机溶剂萃取时，由于乙醇的影响，有机相与水相不能分层，目标物的萃取分离效果差。因此实验首先降低酒样中乙醇的浓度，分别将白酒样品稀释至5，10，15，20%vol的乙醇浓度，考察了乙醇浓度对角鲨烯提取的影响。结果显示，随着酒度降低，由于稀释倍数增加，角鲨烯峰面积呈减小趋势，而乙醇浓度为20%vol时，由于较高的乙醇浓度对角鲨烯的萃取存在竞争性抑制，角鲨烯的萃取效率较乙醇浓度为15% vol时的萃取效果差。因此实验选择将酒样稀释至15%vol对角鲨烯进行萃取。

2.1.2 萃取溶剂的种类及比例 不同极性的萃取溶剂是影响目标物提取的关键因素。于玲等[17]采用超声辅助分散液液微萃取方法分析空气中溴氰菊酯残留时，考察了不同萃取剂种类对目标物提取的影响，结果表明萃取剂的种类直接影响目标物的提取效率，有效的萃取剂能使目标物从水相中转入有机相，并且萃取后分层效果明显，可提高目标物的萃取效率，这主要基于萃取的相似相溶原理。角鲨烯属于不饱和三萜类化合物，具有非极性，根据相似相溶原理，选择非极性的有机溶剂进行萃取。实验选择白酒分析中常用的非极性萃取剂戊烷和乙醚，以及文献报道提取植物等产品中角鲨烯的常用萃取剂正己烷，比较了单种溶剂与不同比例(3∶1,1∶1,1∶3)的戊烷-乙醚的混合溶剂对萃取的影响。结果显示，正己烷、戊烷萃取白酒中角鲨烯的效果较差，且正己烷的毒性较强，因此不采用正己烷。而乙醚和戊烷的混合溶剂中，随着乙醚比例的增加，萃取效率提高，采用戊烷-乙醚(1∶3)时萃取率趋于最大，但乙醚比例越高分层效果越差。综合考虑，选择戊烷-乙醚(1∶3)的有机溶剂作为萃取剂。

萃取剂体积对萃取效率也有较大的影响。实验选择戊烷-乙醚(1∶3)混合溶剂进行体积优化，分别考察不同体积(0.5,1,2,3,4 mL)的萃取剂对萃取效果的影响。结果显示，萃取剂体积为0.5 mL时峰面积最大，但此时有机相分层少，不易吸取有机相，精密度差。随着萃取剂体积的增加，有机相分层效果好，提取的角鲨烯增加，但由于稀释效应大于提取效率，角鲨烯的峰面积呈下降趋势。综合考虑萃取效果及可操作性，选择萃取剂的体积为1 mL。

2.1.3 萃取级数 由于角鲨烯微量存在于白酒中，为了准确定量以及提高检测灵敏度，考察了每次萃取角鲨烯的提取率。实验选择戊烷-乙醚混合溶剂(1∶3)作为萃取剂，每次加入1 mL萃取剂，共萃取5次。结果显示，随着萃取次数的增加，越来越多的角鲨烯被提取，其中第1次萃取率为76.9%，第2次萃取率为17.2%，第3次为3.2%，第4次为2.2%，第5次为0.5%。从萃取率看出，戊烷-乙醚混合萃取剂(1∶3)提取酒样中绝大部分角鲨烯主要集中在前两次萃取，其提取率达94.1%。因此本实验选择两次萃取，这种多级微萃取的效果优于单次萃取，同时辅以氮吹浓缩，可进一步提高白酒中痕量角鲨烯的检测灵敏度。

实验进一步比较了角鲨烯在不同极性色谱柱上的分离效果。结果表明，角鲨烯在非极性DB-5MS柱和极性柱DB-FFAP上的峰面积相近，但其在非极性色谱柱上分离效果较好，利于准确定量，因此选择非极性的DB-5MS柱分析。

综上，确定了分析酒样中角鲨烯的最优方法为：将10 mL白酒样品稀释至15%vol，采用1 mL戊烷-乙醚混合溶剂(体积比为1∶3)进行多级萃取，并选用非极性的DB-5MS柱进行分离。

2.2 分析方法的评价

根据优化的方法进行GC-MS分析，并对目标峰进行标准品比对及NIST谱库比对，确认目标峰为角鲨烯，从而使得白酒样品中的角鲨烯得到有效检出。图2为多级液液微萃取结合气相色谱-质谱联用法检测白酒样品中角鲨烯的总离子流图。

将配制好的一系列标准溶液按照上述条件进行多级液液微萃取结合GC-MS分析，绘制标准曲线，以3倍信噪比时的浓度计算角鲨烯的检出限(LOD)，以10倍信噪比时的浓度计算定量下限(LOQ)。结果表明，角鲨烯的线性回归方程为y=0.000 6x-0.979，相关系数(r2)为0.995 5，线性范围为0.62 ～159.88 μg/L，方法的线性范围较宽，角鲨烯的检出限为0.17 μg/L，定量下限为0.55 μg/L，适合白酒中痕量角鲨烯的定量检测。

在优化条件下，分别考察了加标浓度为2,20,40 μg/L时的回收率与相对标准偏差。测得平均加标回收率分别为78.1%,85.0%和103.5%，相对标准偏差分别为12.1%,8.9%和7.0%。方法的准确度和精密度符合定量分析要求。

2.3 不同香型白酒中角鲨烯含量的测定

将不同香型的白酒样品稀释至15%vol，按上述建立的方法测定白酒中角鲨烯的含量。每种香型白酒选取1个酒样做标准品加标实验，其中酱香型白酒中角鲨烯的加标量为50 μg/L，浓香型白酒加标量为5 μg/L，清香型白酒加标量为20 μg/L，其它香型白酒加标量为10 μg/L。计算此方法定量各香型白酒中角鲨烯的回收率，每个酒样重复测定3次计算其相对标准偏差(RSD)。表1结果显示，不同香型白酒中角鲨烯的回收率为89.1%～117.6%，RSD均不大于13.8%，能够满足白酒中ng/L或μg/L级别的微量生物活性三萜角鲨烯的定量分析。

表1 不同香型白酒中角鲨烯的平均含量、回收率与相对标准偏差Table 1 Average concentrations,recoveries and RSDs of squalene in different aroma-type Chinese liquors

图3 不同香型白酒中角鲨烯含量差异图Fig.3 Concentration of squalene in different aroma-type Chinese liquors

对不同香型白酒中的角鲨烯含量进行分析。结果显示，角鲨烯在不同香型白酒中含量分布存在差异，具有一定的香型特征。从各香型白酒角鲨烯的箱线图得出(图3)，酱香型白酒中的角鲨烯含量最高，平均值达49.07 μg/L；其次是清香型白酒，其平均含量和中位数在20 μg/L左右；再次是其它香型白酒，其平均含量和中位数在10 μg/L左右；浓香型白酒中的角鲨烯含量最少，其平均含量和中位数在5 μg/L左右。

根据图3对角鲨烯在同一香型不同品牌白酒中的含量特点进行分析。结果显示，酱香型白酒中角鲨烯的含量范围分布最广，为4.10～112.65 μg/L；其余香型白酒的角鲨烯含量范围稍窄，清香型白酒中角鲨烯含量范围为5.13～34.61 μg/L，浓香型白酒中角鲨烯含量范围为0.71～21.78 μg/L，其它香型白酒中角鲨烯含量范围为1.59～17.72 μg/L。表明角鲨烯在同一香型不同品牌白酒之间存在较大差异。

3 结 论

本文采用多级液液微萃取结合GC-MS联用技术分析白酒中的微量角鲨烯，并对多级液液微萃取的相关参数进行优化，得到了最优分析条件。将方法用于角鲨烯的检测，得其线性系数为0.995 5，检出限低至0.17 μg/L，当加标浓度为2,20,40 μg/L时加标回收率分别为78.1%,85.0%和103.5%，RSD分别为12.1%,8.9%和7.0%，分析参数能满足白酒中微量生物活性三萜角鲨烯的定量分析。

采用建立的定量方法分析不同香型不同品牌白酒中的角鲨烯含量，结果表明角鲨烯在不同香型白酒中的含量分布存在较大差异，且在同一香型不同品牌白酒中的含量差异也较大，其中酱香型白酒中的角鲨烯含量最高，其次是清香型白酒，而浓香型白酒中的角鲨烯相对较少。相关研究可为白酒中角鲨烯等物质的分析检测提供方法参考，也为挖掘传统白酒中生物活性物质提供思路借鉴，同时也进一步确证了传统白酒中存在微量的难挥发性的大分子物质。

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Quantitation of Squalene in Chinese Liquor Using Multistage Liquid-Liquid Microextraction Coupled with Gas Chromatography-Mass Spectrometry

HU Guang-yuan,LIN Lin,WANG Di-qiang,WANG Li*

(Technique Center of Kweichow Moutai Co.Ltd.,Renhuai 564501，China)

A multistage liquid-liquid microextraction(LLME) coupled with GC-MS method was developed to determine squalene in Chinese liquor.After diluting the liquor sample,a multistage microextraction was carried out using pentane-diethyl ether mixture(1∶3,by volume),then the organic phase was concentrated with nitrogen,and analyzed by GC-MS.The result indicated that squalene had a good linearity in the range of 0.62-159.88 μg/L,with a correlation coefficient of 0.995 5.The detection limit of squalene was as low as 0.17 μg/L.The average recoveries of squalene at spiked levels of 2,20,40 μg/L were 78.1%,85.0%,103.5%,respectively,with relative deviations of 12.1%,8.9%,7.0%,respectively.With the advantages of simplicity,accuracy,high extraction efficiency and low consumption of organic solvent,this method was suitable for the quantitative analysis of squalene in Chinese liquor.

squalene;Chinese liquor;multistage LLME;GC-MS;quantitation analysis

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.04.016

2016-08-21；

2016-11-27

O657.63；O624.13

A

1004-4957(2017)04-0534-05

*通讯作者：王 莉，硕士，工程技术应用研究员，研究方向：白酒风味与品质，Tel：0851-2386504，E-mail:eileenjn@126.com