何培新，李芳莉，郑燕，张勇，胡晓龙*，孙西玉，郭福利

（1.郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州450001；2.河南牧业经济学院生物工程学院，河南郑州450001；3.河南张弓老酒酒业有限公司，河南宁陵476733）

浓香型白酒窖泥梭菌的分离及其挥发性代谢产物分析

何培新1，李芳莉1，郑燕1，张勇1，胡晓龙1*，孙西玉2，3，郭福利3

（1.郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州450001；2.河南牧业经济学院生物工程学院，河南郑州450001；3.河南张弓老酒酒业有限公司，河南宁陵476733）

从河南张弓老酒酒业的窖泥中分离厌氧梭菌属细菌，基于微生物16S rRNA基因序列分析对分离到的细菌进行鉴定；采用顶空固相微萃取（HS-SPME）和气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术萃取和检测了分离菌株发酵液中的挥发性代谢产物。结果表明，分离到的88株细菌与基因库中8种芽孢梭菌（Clostridium celerecrescens、C.cochlearium、C.carboxidivorans、C.sporogenes、C.sartagoforme、C.thermopalmarium、C.aurantibutyricum和C.butyricum）具有较高的序列同源性。从分离菌株的发酵液中共检测到20种酯类、12种酸类、11种醇类和4种醛类物质，还有一部分酮类和醚类物质；其中主要的酯类物质有丁酸乙酯、丁酸丁酯、3-苯丙酸乙酯等，酸类物质主要为丁酸和己酸，醇类物质主要为丁醇、己醇和3-苯丙醇。本研究有助于进一步揭示窖泥中可培养梭菌菌群对浓香型白酒风味的贡献。

浓香型白酒；窖泥；厌氧梭菌；16S rRNA基因；挥发性代谢产物

浓香型白酒以窖池为发酵容器，采用半开放式多菌种协同固态发酵的方式生产，窖泥微生物对白酒品质改善及特征香气的形成具有重要的影响[1-2]。窖泥微生物的种类繁多，包括细菌、古生菌、放线菌、霉菌和酵母菌等，其中以细菌和古生菌为主[3]。窖泥微生物的数量、群落组成及其多样性、种群间的相互作用及代谢产物的多样性直接影响着窖泥的质量及窖泥微生态平衡，进而影响浓香型白酒的品质。在窖泥微生物群落中，厌氧梭菌一直被认为是影响白酒风味物质形成的重要微生物，如产己酸梭菌（Clostridium kluyveri）、产丁酸梭菌（C.butyricum）和酪丁酸梭菌（C.tyrobutyricum）等[4-5]。由于己酸是形成浓香型白酒特征香气物质己酸乙酯的重要前体物质，许多关于窖泥中梭菌的研究主要集中于产己酸梭菌的分离培养及其在窖泥护理与制备中的应用[6]。然而，对其他可培养梭菌的分离、鉴定及其发酵产生的挥发性代谢物的研究较少。本研究分离和初步鉴定了浓香型白酒窖泥中的厌氧梭菌，并分析了分离菌株发酵产生的挥发性物质种类，对提高白酒品质、开发新型白酒产品等具有一定的参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

窖泥样品采自河南张弓老酒酒业股份有限公司65年和45年窖龄的窖池，分别于窖池底部和窖壁中部处取样。将上述样品分别装入相应无菌取样袋中，并置冰盒中运输至实验室，4℃保存备用。

蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、葡萄糖、可溶性淀粉、氯化钠、醋酸钠、半胱氨酸盐酸盐、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸铵、巯基乙酸钠、碳酸钙、乙醇：国药集团化学试剂有限公司；Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒：生工生物工程（上海）股份有限公司。所有试剂均为分析纯。

强化梭菌培养基（reinforcedclostridiummedium，RCM）液体培养基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏3g，葡萄糖5 g，可溶性淀粉1 g，氯化钠5 g，醋酸钠3 g，半胱氨酸盐酸盐0.5 g，去离子水1 000 mL，121℃灭菌20 min，pH自然。

RCM固体培养基：RCM液体培养基添加2%琼脂。

胚胎干细胞（embryonic stem，ES）液体培养基：乙酸钠5 g，磷酸氢二钾0.4 g，硫酸镁0.2 g，硫酸铵0.5 g，酵母膏5 g，蛋白胨5 g，半胱氨酸盐酸盐0.3 g，巯基乙酸钠0.3 g，碳酸钙10 g，去离子水1 000 mL，pH 7.0，121℃灭菌20 min，接种前加入乙醇20 mL。

ES固体培养基：ES液体培养基添加2%琼脂。

1.2 仪器与设备

LDZX-50KBS高压灭菌锅：上海申安医疗器械厂；C1000TouchTMPCR、紫外凝胶成像仪：美国Bio-Rad公司；7890A-5975C气相色谱-质谱（gas chromatography mass spectrometer，GC-MS）联用仪：安捷伦科技（中国）有限公司；C-312.5L密封培养罐及厌氧产气袋C-1：日本三菱集团。

1.3 方法

1.3.1 窖泥梭菌的分离培养

称取窖泥样品10 g，加入盛有100 mL无菌水及10粒玻璃珠（φ=3 mm）的三角瓶中，25℃、200 r/min振荡20 min。将窖泥悬浮液于80℃水浴10 min杀死营养体细胞，分别接种体积分数5%于100 mL RCM和100 mL ES液体培养基，37℃富集培养4～6 d。将富集培养液采用10倍系列稀释，吸取10-4～10-7稀释度的菌悬液200 μL涂布于相应的RCM和ES平板，每个稀释度涂布三板。接种后的平板置密封培养罐内，37℃培养3 d。对各种不同特征的菌落进行平板划线纯化，获得单菌落[7]。

1.3.2 细菌的发酵培养

将分离的梭菌菌株单菌落接种15 mL RCM或ES液体培养基（分装于20 mL的大试管中），置厌氧袋内，37℃恒温条件下培养48 h，用作种子液。吸取种子液，按5%的接种量接种至100 mL RCM和ES液体培养基，37℃静置培养4～6 d。吸取适量发酵液分别用于细菌基因组DNA提取和挥发性代谢产物检测。

1.3.3 DNA的提取、PCR扩增及系统发育树的构建

吸取细菌发酵液2 mL置于无菌EP管中，10 000 r/min离心3 min，弃去上清液。菌体沉淀采用Ezup柱式细菌基因组DNA提取试剂盒（上海生工）并按操作步骤提取基因组DNA。

利用16S rRNA基因通用引物27 F（5′-AGAGTTTGA TCCTGGCTCA-3′）和1492 R（5′-GGTTACCTTGTTACG ACTT-3′）进行PCR扩增[8]。扩增体系如下：1 μL引物27F（10 μmol/L），1 μL引物1492R（10 μmol/L），0.15 μLTaq酶（5 U/μL），2.5 μL 10×buffer，4 μL脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）（各2.5 mmol/L），1 μL DNA模板，加无菌水补足至25 μL。PCR扩增反应条件如下：94℃预变性5 min；94℃变性45 s，60℃复性45 s，72℃延伸1 min，30个循环；最后72℃延伸10 min。利用1%琼脂糖电泳检测扩增产物，扩增产物目的片段约为1500bp。利用SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒（上海生工）回收目的片段，最后将扩增产物送至公司测序（上海生工）。将测得的细菌16S rRNA基因序列在美国国家生物技术信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）在线数据库中进行BLAST比对分析，并将测定菌株的16SrRNA基因序列与其同源性最高的序列采用Mega 5.0软件中的邻接法（Neighbor-Joining，NJ）[9]进行系统发育分析。

1.3.4 细菌发酵液的气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析

取菌株发酵液15 mL，在4℃、3 000 r/min条件下离心10 min，吸取上清液8 mL加入萃取瓶中，加入3 g氯化钠和5 μL的薄荷醇（100 μg/L内标液），并加入一个小磁力转子，采用顶空固相微萃取法萃取发酵液中挥发性物质，所用的萃取头为50/30 μm DVB/CAR/PDMS（Supelco），50℃磁力搅拌恒温水浴锅萃取30 min，转速400 r/min；然后将萃取头插入进样口热解吸附5 min，温度260℃。气相色谱条件为：安捷伦HP-5MS色谱柱（30 m×250 μm×0.25 μm），进样口温度230℃，氦气流速1.0 mL/min。升温程序为：40℃保持2 min，以4℃/min的速率升温至230℃保持15 min，然后235℃保持5min。质谱条件为：电子电离（electronionization，EI）源，电子能量70 eV，电子倍增器电压1 617 V，质量扫描范围50～550 u，离子源温度230℃，四极杆温度150℃。

2 结果与分析

2.1 分离菌株16S rRNA基因的系统发育分析及窖泥可培

养厌氧梭菌种群分析

根据菌株菌落形态差异，从各种分离平板上生长的菌落共挑取120株细菌进行分子鉴定。将测定细菌的16SrRNA基因序列提交NCBI进行在线比对分析并构建系统发育树（见图1），发现除少数菌株为芽孢杆菌属（Bacillus）以外，其余88株与GenBank中8种芽孢梭菌（Clostridium）显示＞91%的序列同源性（见表1）。

图188 株厌氧梭菌的系统发育树Fig.1 Polygenetic tree of 88 anaerobicClostridiumspp.

表1 窖泥中分离厌氧梭菌的种类及数量Table 1 Species and quantity of anaerobicClostridiumspp.isolated from pit mud

从表1可以看出，5株代表菌株（R50D1、R50D4、R50 zhong 1、R50 zhong 7和E70D11）与基因库中相关菌株的16S rRNA基因序列的同源性为97%及以上，因而可将这些菌株初步鉴定到种的水平，分别为C.celerecrescens、C.cochlearium、C.carboxidivorans、C.sporogenes和C.bu tyricum。其他3个菌株（R50zhong10、E50zhong4和R70D1）与基因库中最高相似菌菌株16S rRNA基因序列的同源性仅为91%～97%之间，表明这些菌株可能属于梭菌属或其近缘属中的新种[10]。分离菌株的分类地位有待于结合其他分类学特征进一步确证。此外，本研究从窖泥中分离到8种芽孢梭菌，远低于基于高通量测序认识的梭菌种类[11]。其原因可能是窖泥本身就是一个低氧、高酒精度、高有机物（有机酸、醇类、酯类及酚类等）含量、多种微生物相互作用的一个复杂的环境，其中大量微生物（包括梭菌）难以独立人工培养。

本研究采用RCM和ES两种培养基分离窖泥中的厌氧梭菌，C.carboxidivorans、C.sartagoforme和C.aurantibutyricum采用RCM培养基分离得到，C.thermopalmarium和C.butyricum采用ES培养基分离得到，其他菌株采用两种培养基均可分离获得。两种培养基的营养成分和环境条件（pH等）不同，因而对窖泥中的梭菌产生了不同的影响。该结果也暗示，采用不同的培养基组合，可能会从浓香型白酒窖泥中分离得到更多的可培养梭菌，从而丰富对窖泥中梭菌多样性的认识。

从表1可以看出，分布于65年窖池窖泥样品中可培养梭菌种类与45年窖泥样品有所不同，主要原因可能是窖泥的理化性质随着窖龄的增加呈现动态变化[12]，进而促使其中微生物群落结构发生相应地改变[13]。其中C.celerecrescens、C.cochlearium和C.sporogenes在不同窖龄窖池的窖泥中均有出现，且C.celerecrescens和C.sporogenes为窖泥中优势可培养梭菌。C.carboxidivorans、C.sartagoforme和C.thermopalmarium是65年窖池窖泥特有梭菌，而C.auran-tibutyricum和C.butyricum是45年窖池窖泥特有梭菌。梭菌是高龄窖池窖泥的主要微生物类群，对维持窖泥的微生态平衡及保持浓香型白酒风格特征具有重要作用[14]。如C.celerecrescens具有降解纤维素的能力。在浓香型白酒发酵过程中有利于将发酵原料或辅料（谷物皮及稻壳等）中的纤维素降解为小分子有机物，同时也有助于发酵谷物中淀粉等物质的释放，进而为其他微生物的生长繁殖提供可利用的碳氮源[15]。C.butyricum的代谢物丁酸可以作为浓香型白酒重要风味物质，同时还可以作为微生物合成己酸的电子受体，进而有利于浓香型白酒主体香味物质己酸乙酯的形成[16]。

2.2 菌株发酵液挥发性代谢物质分析

采用顶空固相微萃取和气质联用的方法对筛选梭菌的发酵液进行风味物质萃取和分析，结果见表2。由表2可知，8种芽孢梭菌的挥发性代谢物主要包括20种酯类（乙酸乙酯、乙酸己酯、甲酸甲酯、己酸乙酯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸丁酯、丁酸丁酯、戊酸丁酯、异戊酸丁酯、异丁酸异戊酯、异戊酸异戊酯、己酸丙酯、己酸丁酯、辛酸乙酯、3-苯丙酸乙酯、苯丙氨酯、乙酸癸酯、2-甲基丁酸-3-甲基丁酯、棕榈酸乙酯、棕榈酸异丙酯）、12种酸类（2,3-二羟基丁二酸、乙酸、丁酸、异戊酸、3-甲基丁酸、2-甲基丁酸、草莓酸、庚酸、辛酸、反油酸、癸酸、十一酸）、11种醇类（丁醇、1-戊醇、正己醇、4-甲基-1-戊醇、3-甲基-1-戊醇、3-甲基-1-己醇、苯乙醇、1-辛醇、3-苯丙醇、1-癸醇、1-十四醇）和4种醛类（苯乙醛、癸醛、壬醛、肉豆蔻醛），此外还有2种酮类（2-壬酮、苯乙酮）、1种醚类（二甲基四硫醚）、2种苯并杂环化合物（吲哚、2,3,5,6-四甲基吡嗪）和2种含硫类化合物（二甲基二硫、二甲基三硫）。这些结果表明，分离得到的梭菌具有发酵产生多种白酒风味物质或其前体物质的能力，对浓香型白酒香味物质的形成具有重要的影响。与浓香型白酒原酒风味物质相比，分离梭菌在RCM和ES培养基上产生的风味物质的种类较少[17]。原酒生产采用多种粮食原料和高温曲作用，在具有复杂微生物群落的窖池中经过较长时间的酿造而成。窖泥中含有己酸菌和丁酸菌等多种功能细菌，将酿造过程中产生的酸类和醇类等前体物质，通过酯化作用反应生成己酸乙酯、丁酸乙酯等白酒重要风味物质[18]。

表2 菌株发酵液挥发性物质的GC-MS分析结果Table 2 Results of GC-MS analysis of volatile components ofClostridumspp.fermentation broth

梭菌R50D1（C.celerecrescens）、R50D4（C.cochlearium）、R50zhong7（C.sporogenes）、R50zhong10（C.sartagoforme）和R70D1（C.aurantibutyricum）的RCM发酵液酸类物质所占比例较大，其中丁酸的含量较高，菌株R50D1（C.celerecrescens）、R50D4（C.cochlearium）的RCM发酵液中丁醇的含量相对较高（表2）。作为白酒的四大酸之一，丁酸可在窖泥中的一些霉菌、酵母菌及乳酸菌产生的酯化酶的作用下，与乙醇和丁醇发生酯化反应生成丁酸乙酯和丁酸丁酯。丁酸乙酯作为浓香型白酒四大酯类物质之一，具有浓郁的甜果香风味，直接影响白酒的口感。R50zhong7（C.sporogenes）的RCM发酵液含有少量的具有甜香味的2,3,5,6-四甲基吡嗪，R50D1（C.celerecrescens）、R50 zhong 1（C.carboxidivorans）的RCM发酵液中含有具有具有咸菜风味的二甲基二硫和二甲基三硫，有助于白酒特征风味物质的形成[19]，菌株E50 zhong 1（C.sporogenes）、E50 zhong 3（C.celerecrescens）、E50 zhong 4（C.thermopalmarium）、E70D5（C.cochlearium）和E70D11（C.butyricum）的ES发酵液含有较高比例的吲哚。吲哚具有强烈的粪便臭味，含量过高将在很大程度上降低浓香型白酒的品质。通过不同的液体培养基对菌株进行培养，由于培养基成分的不同，其发酵液的风味物质有很大的差别。菌种C.celerecrescens（R50D1）、C.cochlearium（R50D4）和C.sporogenes（R50zhong7）的RCM发酵液中含有较高含量的丁酸，C.celerecrescens（E50 zhong 3）、C.cochlearium（E70D5）和C.sporogenes（E50 zhong 1）的ES发酵液中含有较高比例的醇类，以丁醇的含量相对较高，还有一定比例的吲哚。因此，这些分离菌株用于白酒酿造，必须进行进一步的菌种选育或者发酵条件优化等工作，以尽量降低发酵产生吲哚物质。

比较分析梭菌发酵液中挥发性物质的种类和相对含量，可以更具体地了解窖泥中部分梭菌的代谢性质及其代谢产物对白酒风味物质的影响，为生产与维护窖泥、改善白酒品质，尤其是在提高液态法生产白酒的品质等方面提供一定理论支撑和技术指导。传统固态法白酒酿造是一个多种微生物相互作用的过程，微生物多样性是白酒风味物质复杂性的重要原因。而液态法生产白酒仅人工接种少数微生物，造成液态法白酒中的酸类、酯类等风味物质的种类和含量较少。采用多种产生风味物质及其前体物质的细菌和产香酵母混合发酵，会有效增加酿造白酒的风味物质种类和浓度。在液态法白酒生产以及固态法酿造的窖泥维护和改造中，添加多种能产生白酒风味物质的窖泥微生物，将会有效提高白酒品质，提高优质品率，增加企业经济效益。

3 结论

从浓香型白酒不同窖龄窖池的窖泥中分离出多株厌氧芽孢梭菌，采用16S rRNA基因序列分析技术初步确定了8株代表性梭菌的分类地位。将8株芽孢梭菌分离物进行人工发酵，采用GC-MS分析了发酵液中的挥发性代谢物质，发现这些菌株均可产生多种浓香型白酒的重要风味物质或其前体物质。菌株R50D1（C.celerecrescens）、R50D4（C.cochlearium）、R50zhong7（C.sporogenes）、R50zhong10（C.sartagoforme）和R70D1（C.aurantibutyricum）在RCM液体培养基中的代谢物主要为丁酸；菌株E50 zhong 1（C.sporogenes）、E50 zhong 3（C.celerecrescens）、E50 zhong 4（C.thermopalmarium）、E70D5（C.cochlearium）和E70D11（C.butyricum）的ES发酵液中具有强烈粪便臭味的吲哚的相对含量较高。窖泥中厌氧梭菌的分离、鉴定及其挥发性代谢物分析，可为有效改善窖泥质量、生物强化白酒风味物质、溯源及控制白酒异嗅物质及开发液态法白酒生产菌种等提供理论和技术指导。

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Isolation and volatile metabolites ofClostridiumspp.in pit mud of strong-flavorBaijiu

HE Peixin1,LI Fangli1,ZHENG Yan1,ZHANG Yong1,HU Xiaolong1*,SUN Xiyu2,3,GUO Fuli3
(1.School of Food and Biological Engineering,Zhengzhou University of Light Industry,Zhengzhou 450001,China; 2.School of Biological Engineering,Henan University of Animal Husbandry and Economy,Zhengzhou 450001,China; 3.Henan Zhanggong Laojiu Wine Co.,Ltd.,Ningling 476733,China)

AnaerobicClostridiumspp.were isolated from pit muds at Henan Zhanggong Laojiu,and identified based on 16S rRNA gene sequence analysis.The volatile metabolites of these isolates were extracted by HS-SPME and determined by GC-MS.The results suggested that the 88 bacterial strains showed high sequence similarities with 8Clostridiumspp.in GenBank,includingClostridium celerecrescens,C.cochlearium,C.carboxidivorans,C.sporogenes,C.sartagoforme,C.thermopalmarium,C.aurantibutyricum,andC.butyricum.A total of 20 esters,12 acids,11 alcohols and 4 aldehydes,and some ketones and ethers were detected from the metabolites ofClostridiumspp.fermentation broth.Among them,ethyl butyrate, butyl butyrate and 3-benzene ethyl propionate were dominant esters;butyric acid and caproic acid were dominant acids;butanol,hexanol and 3-phenylpropanol were main alcohols.The study was helpful to reveal the contribution of the cultivableClostridiumspp.from pit mud to the flavor constitution of strong-flavorBaijiu(Chinese liquor).

strong-flavorBaijiu;pit mud;anaerobicClostridium;16S rRNA gene;volatile metabolites

TS261.1

0254-5071（2017）04-0045-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.04.010

2016-12-09

郑州轻工业学院研究生科技创新项目（ZQ2015-3738）；中国轻工业浓型白酒固态发酵重点实验室开放基金项目（2017JJ012）

何培新（1970-），男，教授，博士，研究方向为发酵工程。

*通讯作者：胡晓龙（1984-），男，讲师，博士，研究方向为白酒酿造工程。