钟淑娟，郑思超，李咏梅，黎行山，苏瑞真，丘秀玉

（广州医科大学附属第五医院，广东 广州 510700）

·实验研究·

双嘧达莫对阿尔茨海默病大鼠学习记忆的改善作用及机制研究

钟淑娟，郑思超△，李咏梅，黎行山，苏瑞真，丘秀玉

（广州医科大学附属第五医院，广东 广州 510700）

目的探讨双嘧达莫对阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）的防治作用及其作用机制。方法 海马注射α-淀粉样蛋白（Aα25-35）建立大鼠AD模型，选用敞箱试验、Morris水迷宫试验和避暗试验评价双嘧达莫的抗AD疗效；采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测海马环磷酸腺苷（cAMP）水平；采用荧光实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）、免疫印迹法分别检测大鼠海马脑源性神经营养因子（Brainderived neurotrophic factor，BDNF）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素1α（interleukin-1α，IL-1α）、白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）mRNA表达和磷酸化环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)、核因子(NF)-αB p65蛋白的表达情况。结果 双嘧达莫连续给药对大鼠的水平运动得分和垂直运动得分均无明显影响，能显著增加AD大鼠平台象限的游泳时间和平台穿越次数，明显延长AD大鼠进入暗室潜伏期；分子生物学检测结果显示，与假手术组比较，Aα25-35注射大鼠海马cAMP含量、p-CREB蛋白表达、BDNF mRNA表达显著减少，NF-αB p65蛋白及TNF-α，IL-1α，IL-6的mRNA表达则明显增加，而双嘧达莫均能不同程度逆转Aα25-35引起的变化。结论 双嘧达莫对AD大鼠的学习记忆有显著改善作用，其作用机制可能与激活海马cAMP／CREB／BDNF信号通路和抑制NF-αB介导的炎性反应有关。

双嘧达莫；阿尔茨海默病；α-淀粉样蛋白；学习记忆；作用机制

阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）是一种复杂性的神经系统退行性疾病，其临床表现有进行性的学习记忆力减退、认知障碍、行为异常等[1]。血小板抑制剂双嘧达莫具有抗凝等多种生理功能，临床常与低剂量阿司匹林联用预防脑中风[2]。有研究显示，双嘧达莫能改善东莨菪碱造成的斑马鱼学习记忆力障碍[3]，提示其在防治AD中可能有积极作用。而关于双嘧达莫对β-淀粉样蛋白（Aβ）造成的病理性变化及其在AD中的可能性应用仍需进一步研究。本研究中拟采用Aβ构建大鼠痴呆模型，以观察双嘧达莫对AD的干预效果及可能的作用机制，为该药防治AD提供依据。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物、试药与仪器

1.1.1 试验动物

健康雄性 SD成年大鼠 60只，SPF级，体质量（300±15）g，购自广东省实验动物中心，动物合格证号为SCXK（粤）2014-00114。所有大鼠均正常饲养，自由饮水、进食，饲养温度24～26℃，相对湿度40% ～60%。1.1.2 试药

双嘧达莫（dipyridamole，DIP）、盐酸多奈哌齐（donepezil，Don）、Aβ25-35均购于美国Sigma-Aldrich公司；水合氯醛（天津科密欧化学试剂有限公司）；磷酸化环磷腺苷效应元件结合蛋白（CREB）、NF-κB p65兔单抗、二抗羊抗兔均购于Cell Signaling Technology公司；cAMP酶联免疫吸附法(ELISA)检测试剂盒（上海生物工程股份有限公司）；荧光定量 PCR试剂盒（美国Promega生物技术有限公司）；引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。

1.1.3 仪器

单臂脑立体定位仪（深圳瑞沃德生命科技有限公司）；注射泵（瑞典CMA公司）；Morris水迷宫（中国医学科学院药物研究所）；避暗箱（中国医学科学院药物研究所）；多功能酶标仪 （瑞士Tecan公司）；Bio-Rad免疫印迹系统（美国Bio-Rad公司）；Mx3000P型实时定量PCR仪（美国Stratagene公司）

1.2 试验方法

1.2.1 动物分组、造模与给药

分组：将60只成年大鼠随机分为假手术组，模型组，双嘧达莫低（2.5 mg／kg）、中（5 mg／kg）、高（10 mg／kg）剂量组，以及多奈哌齐片阳性药（1 mg／kg）组，各10只。

造模：大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉后固定于脑立体定位仪上，头顶部去毛，75%乙醇消毒，切开头顶部皮层，找到前囱并以其为坐标原点，海马坐标（AP-3.5 mm，ML±2.0 mm，DV-3.0 mm）注射Aβ25-35或无菌生理盐水2 μL，注射速率为0.5 μL／min，注射结束后留针5 min使溶液充分弥散和防止退针时溶液反流，各组动物手术后消毒并缝合切口皮肤。

给药：各组大鼠Aβ25-35注射后24 h给予相应剂量药物，假手术组和模型组分别给予等体积生理盐水，每天1次，连续灌胃14 d后开始行为学评价。行为学测试期间，每天给药30 min后再进行试验。

1.2.2 敞箱试验

给药14 d后进行敞箱试验，以评价造模及药物对大鼠自主活动的影响。试验前，将大鼠移至实验室适应环境2 h。测试时，将大鼠放入75 cm×75 cm的正方形敞箱中央位置，观察大鼠在5 min内穿越格子次数和直立次数，分别代表水平运动得分和垂直运动得分。试验结束后，清理每只大鼠箱底粪便，并用10%乙醇清洁底面，电吹风吹干，避免影响下一只大鼠的试验。

1.2.3 Morris水迷宫试验

在直径为120 cm、深度为50 cm的水池中放置直径为10 cm的平台，试验期间维持水温为（21±2）℃。人为将水池平均划分为4个象限，将大鼠从入水点放入水池中，借助水池周围环境的提示，找到隐藏的平台，并让大鼠在平台上停留20 s。若大鼠在90 s内仍不能找到平台，实验者将其引至平台并停留20 s。每只大鼠每天分别从4个入水点入水，学习如何顺利找到隐藏平台，连续5 d。第6天撤去水迷宫中的平台，固定1个入水点，影像跟踪系统记录大鼠在90 s内在原有平台象限探索的时间和穿越平台的次数。

1.2.4 避暗试验

水迷宫结束后第2天开始避暗试验。第1天进行适应训练，试验装置不通电，将大鼠放入明箱并背向暗箱，记录大鼠在5 min内第1次进入暗箱的时间。第2天，试验装置通电，将大鼠放在暗箱，背靠洞口，当大鼠被电刺激后3 s，立即取出，训练结束。第3天进行记忆保留能力检测，试验装置不通电，将大鼠放在明箱，背靠洞口，记录5 min内大鼠进入暗箱的时间，即为潜伏期。

1.2.5 大鼠海马中环磷酸腺苷（cAMP）含量检测

海马组织按质量体积比1∶5加入RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂）冰上超声匀浆后，4℃，12 000 r／min离心10 min，收集上清液。根据 ELISA试剂盒步骤测定cAMP的含量。

1.2.6 大鼠海马相关mRNA和蛋白表达检测

取海马组织进行超声裂解后，收集上清液，分别进行RNA和蛋白的提取。实时定量聚合酶链反应（RTPCR）荧光定量检测脑源性神经营养因子（BDNF）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）和白细胞介素6（IL-6）mRNA的变化；聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行 Western blot试验，检测磷酸化CREB和NF-κB p65蛋白水平的变化。

1.3 统计学处理

采用SPSS 13.0统计学软件进行分析。组间两两比较采用 LSD-t分析法。试验结果以均数±标准差（±s）表示。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对自主活动的影响

敞箱试验结果见图1。可见，各组大鼠间的水平运动得分和垂直运动得分比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），说明手术及各组药物对大鼠的自主活动均无影响。

图1 双嘧达莫对AD大鼠敞箱试验得分的影响（n＝10）

2.2 Morris水迷宫试验

与假手术组相比，模型组大鼠原有平台象限游泳时间和穿越平台次数均显著减少（P＜0.01），提示Aβ25-35注射成功建立AD模型。与模型组相比，给予双嘧达莫或多奈哌齐均可增加大鼠平台象限的游泳时间和穿越平台次数(见图2)。其中，中、高剂量双嘧达莫显著增加AD大鼠在平台象限的游泳时间（P＜0.01），高剂量双嘧达莫显著增加AD大鼠穿越平台的次数（P＜0.01）。

2.3 避暗试验

在适应训练中，各组大鼠进入暗室潜伏期的差异均无显著性（P＞0.05），表明各组大鼠之间喜暗及钻洞的习性无显著性差异。经足底电击24 h后，与假手术组相比，模型组大鼠进入暗室的潜伏期明显缩短（P＜0.01）；给予双嘧达莫或多奈哌齐均可延长大鼠进入暗室的潜伏期，其中，中、高剂量双嘧达莫效果显著。详见图3。

2.4 对海马组织cAMP水平的影响

图2 双嘧达莫对AD大鼠在Morris水迷宫中平台象限游泳时间和穿越平台次数的影响（n＝10）

图3 双嘧达莫对AD大鼠避暗试验进入暗室潜伏期的影响（n＝10）

ELISA试验结果显示，与假手术组相比，Aβ25-35注射显著降低大鼠海马内cAMP的水平（P＜0.01）。双嘧达莫连续给药增加大鼠海马内cAMP水平，且增加呈剂量依赖性，其中，中、高剂量组的效果与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）。详见图4。

图4 双嘧达莫对AD大鼠海马内cAMP水平的影响（n＝4）

2.5 对海马内磷酸化CREB和NF-αB p65蛋白表达的影响

由于双嘧达莫对cAMP具有明显的调控作用，而p-CREB和NF-κB p65为下游重要因子，故采用免疫印迹法检测两者在海马内的表达情况。由图5可见，与假手术组比较，模型组大鼠海马内p-CREB蛋白表达明显降低，而NF-κB p65蛋白的表达则显著上升（P＜0.01）。说明Aβ25-35对cAMP／CREB通路产生了抑制作用，同时激活了NF-κB通路。不同剂量的双嘧达莫均呈现一定程度的逆转作用，其中中、高剂量双嘧达莫可显著增加p-CREB的蛋白表达，减少NF-κB p65的蛋白表达（P＜0.05，P＜0.01）。

图5 双嘧达莫对AD大鼠海马内p-CREB和NF-αB p65蛋白表达的影响（n＝3）

2.6 对海马内 BDNF，TNF-α，IL-1α和 IL-6的mRNA表达的影响

RT-PCR试验结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠海马内BDNF的mRNA表达水平明显下降，炎症相关因子TNF-α，IL-1β，IL-6 mRNA的表达则显著增加，详见图6。与模型组相比，双嘧达莫各剂量均能显著增加AD大鼠海马内BDNF mRNA的表达（P＜0.05，P＜0.01），对炎症因子具有不同程度的抑制作用。其中，双嘧达莫中、高剂量可显著减少大鼠海马内TNF-α 和IL-1β mRNA水平（P＜0.05，P＜0.01），高剂量对IL-6 mRNA表达有明显的抑制作用（P＜0.05）。

3 讨论

本研究中首先采用经典的Morris水迷宫试验和避暗试验对双嘧达莫进行药效学评价。试验结果表明，双嘧达莫能有效改善Aβ25-35造成的大鼠学习记忆障碍。海马为与学习记忆功能高度相关的脑区[4]，通过分子生物学方法试验进一步发现，双嘧达莫增强大鼠学习记忆力的机制可能与激活海马cAMP／CREB／BDNF通路和抑制NF-κB的抗炎作用有关。

针对AD的发病机制，目前公认研究得最透彻的是β-淀粉样蛋白假说[5]。基于该假说开发的经典AD动物模型一般采用Aβ进行侧脑室或海马注射[6]。本研究中通过海马注射Aβ成功建立了AD大鼠模型，行为学试验结果表现为，Morris水迷宫中大鼠穿越平台次数和原有平台象限探索时间减少，避暗试验大鼠进入暗室潜伏期缩短。双嘧达莫连续给药2周后（行为学期间保持给药）可有效逆转上述指标的下降，表明双嘧达莫具有逆转AD大鼠学习记忆功能损伤的作用。

双嘧达莫为嘧啶吡啶类衍生物，作为非选择性磷酸二酯酶（PDE）抑制剂和核苷转运体抑制剂，具有抗血小板及舒张血管的双重特性，临床常与低剂量阿司匹林联用于脑卒中的二级预防[2]。脑卒中患者恢复期常会出现认知或记忆障碍的后遗症，双嘧达莫增强学习记忆功能的发现是对脑卒中二次预防策略的重要补充研究。双嘧达莫不仅可抑制细胞内腺苷的摄取，还可抑制PDE对cAMP的水解，提高细胞内cAMP的水平，激活其下游相关信号通路[7]。有研究显示，cAMP／CREB／BDNF通路与学习记忆密切相关，该通路的缺失或受损可能参与了AD的发生[8]。而关于双嘧达莫用于神经系统退行性疾病（尤其是AD）的研究报道较少。

图6 双嘧达莫对AD大鼠海马内相关mRNA表达水平的影响（n＝3）

本研究中发现，双嘧达莫可增加海马内cAMP水平，进而通过磷酸化CREB，介导BDNF的转录，可能是双嘧达莫增加学习记忆最重要的机制之一。随着对AD发病机制的研究，有研究者提出新的理论，认为AD患者大脑神经元的破坏不是简单的细胞外Aβ沉淀，大脑慢性炎性反应是发病过程的一个关键环节[9]。双嘧达莫抑制大鼠海马内NF-κB的活化，并在不同程度上对致炎因子TNF-α，IL-1β，IL-6有较好的抑制作用。因此，双嘧达莫的抗神经炎症效应可能是其延缓AD进展的另一作用机制。

综上所述，双嘧达莫在Aβ诱导的AD动物模型上具有显著增强学习记忆功能的作用，其作用机制可能与通过激活海马cAMP／CREB／BDNF信号通路和抑制NF-κB的核转录有关。

[1]Vital TM，Hernandez SS，Stein AM，et al.Depressive symptoms and level of physicalactivity in patients with Alzheimer′s disease[J].Geriatr Gerontol Int，2012，12（4）：637-642.

[2]Li X，Zhou G，Zhou S，et al.The efficacy and safety of aspirin plus dipyridamole versus aspirin in secondary prevention following TIA or stroke：a meta-analysis of randomized controlled trials[J].J Neurol Sci，2013，332（1-2）：92-96.

[3]Bortolotto JW，Melo GM，Cognato GD，et al.Modulation of adenosine signaling prevents scopolamine-induced cognitive impairment in zebrafish[J].Neurobil Learn Mem，2015，118：113-119.

[4]Elfman KW，Aly M，Yonelinas AP.Neurocomputational account of memory and perception：Thresholded and graded signals in the hippocampus[J].Hippocampus，2014，24（12）：1672-1686.

[5]Barage SH，Sonawane KD.Amyloid cascade hypothesis：Pathogenesis and therapeutic strategies in Alzheimer′s disease[J].Neuropeptides，2015，52：1-18.

[6]Bergin DH，Jing Y，Zhang，H，et al.A single intracerebroventricular Aα25-35 infusion leads to prolonged alterations in arginine metabolism in the rat hippocampus and prefrontal cortex[J].Neuroscience，2015，298：367-379.

[7]Liu Y，Oh SJ，Chang KH，et al.Antiplatelet effect of AMP-activated protein kinase activator and its potentiation by the phosphodiesterase inhibitor dipyridamole[J].Biochemical Pharmacology，2013，86（7）：914-925.

[8]Lee D.Global and local missions of cAMP signaling in neural plasticity，learning，and memory[J].Front Pharmacol，2015，6：161.

[9]Eikelenboom P，Veerhuis R，Scheper W，et al.The significance of neuroinflammation in understanding Alzheimer′s disease[J].J Neural Transm（Vienna），2006，113（11）：1685-1695.

Improvement Effects and Mechanism of Dipyridamole on Learning and M emory in Rats with Alzheimer′s Disease

Zhong Shujuan，Zheng Sichao，Li Yongmei，Li Hangshan，Su Ruizhen，Qiu Xiuyu
（The Fifth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou，Guangdong，China 510700）

Objective To investigate the preventive and therapeutic effects of Dipyridamole in Alzheimer′s disease（AD）and the mechanism of action.M ethods The AD model was developed by mircoinjection of Aβ25-35into hippocamups of rats.Open field test，Morris water maze test and step-through passive avoidance test were used to evaluate the anti-dementia effects of Dipyridamole.The hippocampal cAMP content were detected by using enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）.The mRNA expression of BDNF，TNF-α，IL-1β and IL-6 in hippocampus were examined by RT-PCR.The protein expression of p-CREB and NF-κB p65 were examined by immunoblotting test(IBT).Results Dipyridamole continuously treatment didn′t affect the crossing scores and rearing scores in rats.In the Morris water maze test，it evidently increased the swimming time and crossing times in platform quadrant in AD rats，and it significantly prolonged latency to the dark compartment in AD rats.The biochemical resutls indicated that compared with the sham group，cAMP contents，p-CREB expression and BDNF mRNA decreased significantly in Aβ25-35injected rats，while the NF-κB p65 expression，TNF-α mRNA，IL-1β mRNA and IL-6 mRNA increased significantly.The changes of Aβ25-35could be reversed at the different levels by Dipyridamole.Conclusion Dipyridamole can significantly enhance learning and memory function in AD rats，the mechanism may be related to the activation of cAMP／CREB／BDNF signaling pathway and inhibition of NF-κB mediated inflammatory response.

Dipyridamole；Alzheimer′s disease；β-amyloid；learning and memory；mechanism of action

R965.2；R971

A

1006-4931(2017)06-0020-05

2016-12-08)

10.3969／j.issn.1006-4931.2017.06.006

钟淑娟（1975-），女，大学本科，主管药师，研究方向为神经药理学，（电话）020-82288145（电子信箱）843118547＠qq.com。

△通讯作者：郑思超，博士研究生，研究方向为杂环化合物的多组分合成及其活性，（电话）020-82288145（电子信箱）sichaozheng＠126.com。