林三清，周中流，杨红艳，夏敬民，杨桂珍，周良霞

（岭南师范学院化学化工学院，广东 湛江 524048）

·实验研究·

柠檬桉叶总黄酮提取工艺及其清除自由基活性研究*

林三清，周中流△，杨红艳，夏敬民，杨桂珍，周良霞

（岭南师范学院化学化工学院，广东 湛江 524048）

目的研究柠檬桉叶总黄酮的最佳提取工艺，测试其清除自由基活性。方法 采用正交试验法，考察乙醇体积分数、提取次数、料液比及提取时间4个因素对该工艺的影响；采用体外清除自由基活性测试方法，以清除DPPH和ABTS自由基能力为指标，评价柠檬桉叶总黄酮清除自由基的能力。结果 确定其最佳提取工艺条件，料液比为1∶15（g／mL），提取溶剂为60%乙醇，提取时间为每次1 h，提取次数为3次。按照该工艺提取柠檬桉叶总黄酮得率为0.312 7%。结论 优选出的柠檬桉叶总黄酮最佳提取工艺条件对进一步的工艺开发有较好的参考价值，柠檬桉叶总黄酮具有较强的清除自由基能力，为开发中药保健品提供了一定实验室依据。

柠檬桉叶；总黄酮；提取工艺；自由基

桉树是世界上生长最快的著名树种，主要有柠檬桉、窿缘桉、直杆桉和蓝桉等[1]。目前，广东湛江是柠檬桉的主产区，现有桉林面积已达320余万亩，年每亩可采鲜叶约1.0×104kg。药理研究表明，柠檬桉叶主要含有挥发油萜类和黄酮类化合物[2]，有抗菌、抗炎、促进药物透皮、清新空气和杀虫等功效[3]。植物总黄酮是一类具有抗氧化和清除自由基功能的活性物质，由于其在抗衰老、治疗心脑血管疾病和预防癌症等方面有显著功效，被广泛地应用于医疗和保健行业，具有极大的开发和应用前景[4-6]。目前，尚未见文献报道柠檬桉叶黄酮类化合物提取工艺及其清除自由基活性的研究。为更好地发掘柠檬桉叶的保健功能，探索其活性功能因子，为柠檬桉叶更广泛地应用于医药食品和开发新型保健品提供参考，本研究中采用正交试验法研究柠檬桉叶总黄酮的最佳提取工艺，继而采用ABTS和DPPH自由基清除法，评价柠檬桉叶总黄酮的清除自由基化活性，为寻找高效、低毒的天然抗氧化剂奠定基础。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

T9型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；RE-5299型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；SB3200DT型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；DS型电热三用水浴锅（北京医疗设备厂）；AY120型电子分析天平（日本岛津公司）；DNM-9602G型酶标仪（北京艾普在线科技有限公司）；DH-250型电热恒温培养箱（北京中兴伟业仪器有限公司）。

1.2 试药

柠檬桉叶(笔者于当地自采)；DPPH试剂（2，2-二苯基苦味酰基苯肼基自由基）、ABTS试剂[2，2’-连氮基-双-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐]，维生素C(VC)、维生素E(VE)、芦丁、没食子酸标准品(中国食品药品检定研究院)；其他化学试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 提取工艺

称取柠檬桉叶2份，每份50 g，分别放入蒸馏烧瓶中，加石油醚（60～90℃）约750 mL于蒸馏烧瓶中，脱脂3 h，共脱脂5次。弃石油醚，倒出，晾干，称定质量，即得已脱脂柠檬桉叶，备用。

称取一定量脱脂柠檬桉叶，按本试验最佳提取工艺条件，回流浸提，过滤，真空干燥，所得提取物用一定量溶剂溶解，定容，采用紫外分光光度法测定提取物中总黄酮的含量。

2.2 柠檬桉叶总黄酮含量测定方法

2.2.1 方法学考察

芦丁标准曲线绘制：取芦丁9.95 mg，精密称定，置25 mL容量瓶，加水至刻度，超声处理至全部溶解，得质量浓度为0.398 0 g／L的溶液。精密吸取芦丁对照品溶液0.40，0.80，1.30，1.60，2.00 mL，置加有200 mg镁粉的25 mL具塞比色管中，各加50%的乙醇至3 mL，摇匀，将比色管置15℃的冰水浴中，缓慢滴加浓盐酸2 mL并不断振摇，盖塞摇匀，加50%的乙醇至5 mL。可观察到对照品溶液变成紫红色。在 500 nm波长下测定系列标准溶液的吸光度，以对照品质量浓度为横坐标(X)、吸光度(Y)为纵坐标进行线性回归，得回归方程 Y＝0.007 7 X-0.044 6(r＝0.999 9)。结果表明，芦丁对照品质量浓度在22.40～111.92 μg范围内与吸光度线性关系良好。

精密度试验：精密称取柠檬桉叶，依法制备供试品溶液，取6份，依法进样，测定吸光度。结果的 RSD为1.03%（n＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取供试品溶液，于配制0，10，20，40，60 min后依法进样，测定吸光度。结果的 RSD为2.02%（n＝5），表明供试品溶液在1 h内稳定。

重复性试验：称取同一批柠檬桉叶6份，每份约10 g，精密称定，同法制备供试品溶液，精密吸取2 mL，依法进样，测定吸光度。结果的 RSD为0.30%（n＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：称取同一批柠檬桉叶6份，每份约10 g，精密称定，依法制备供试品溶液，再精密加入芦丁对照品适量，依法进样测定，计算回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果(n＝6)

2.2.2 含量测定

取供试品溶液2.0 mL，其他步骤同标准溶液测定方法，根据标准曲线求得其质量浓度，计算柠檬桉叶总黄酮平均含量为1.07%。

2.3 正交试验优化提取工艺

2.3.1 因素水平选择

选取乙醇体积分数（因素A）、料液比（因素B）、提取时间（因素C）及提取次数（因素D）4个因素作 L9（34）正交试验。因素水平表见表2。

总黄酮得率（%）＝[（VCD）／（1 000 w）]×100%

式中，V（mL）为试样定容体积；C（g／L）为试样中总黄酮的质量浓度；D为稀释倍数；w（g）为试样质量。

2.3.2 正交试验设计

试验方案见表 3。表 3中出现的 k1，k2，k3分别代表某个因素的不同水平的指标值加和，K1，K2，K3分别代表某个因素的不同水平的指标平均值，R代表极差。

2.3.3 结果分析

直观分析和方差分析结果见表3和表4。可见，影响柠檬桉叶总黄酮提取的因素大小顺序为D＞B＞C＞A，即提取次数为主要影响因素，料液比和提取时间为次要影响因素。对于因素A，K1＞K3＞K2，水平1为最优，即乙醇最佳体积分数为60%；对于因素B，K2＞K3＞K1，水平2为最优，即最佳料液比为1∶15；对于因素C，K1＞K2＞K3，即最佳提取时间为1 h；对于因素D，K3＞K2＞K1，即最佳提取次数为3次。故确定柠檬桉叶总黄酮最佳提取工艺条件为A1B2C1D3，即60%的乙醇，料液比为1∶15，每次提取1 h，加热回流提取3次。

表5 最佳提取工艺验证试验结果(n＝3)

2.3.4 最佳工艺验证试验

称取3份柠檬桉叶50.0 g，精密称定，按最佳工艺条件平行操作，得总黄酮的得率。由表5最佳工艺验证结果表明，用最佳工艺条件提取，柠檬桉叶总黄酮得率(计算公式见后)均高于其他各正交试验值，故本最佳工艺条件合理。同时，平均得率的 RSD＝1.84%(n＝3)，也表明此工艺重复性好，稳定性较好。

2.4 清除自由基活性研究

2.4.1 清除DPPH自由基活性测定[7-9]

准确称取供试品1 mg，加二甲基亚砜(DMSO)100 μL溶解，加无水乙醇900 μL稀释，充分振荡，配制成质量浓度为1 g／L的供试品溶液。用乙醇依次稀释成质量浓度为1.000 000，0.500 000，0.250 000，0.125 000，0.062 500，0.031 250，0.015 625 g／L的溶液。阳性对照品（VC）溶液质量浓度与上述供试品溶液相同。将100 μL不同质量浓度的供试品溶液和100 μL DPPH乙醇溶液置 96孔板小孔内，空白对照孔为100 μL乙醇和100 μL的DPPH乙醇溶液，重复3次，37℃遮光放置反应30 min，测定其在517 nm波长处的吸光度。以VC作阳性对照，按下列公式计算样品对DPPH自由基的清除率。

式中，Ac为加入DPPH试剂后的空白对照吸光度；Ai为加入DPPH试剂后的供试品溶液吸光度；Aj为未加入DPPH试剂时的供试品溶液吸光度。

图1 柠檬桉叶总黄酮清除DPPH自由基作用

图2 柠檬桉叶总黄酮清除ABTS自由基作用

结果见图1。可见，柠檬桉叶总黄酮对自由基DPPH有清除作用，并在试验质量浓度范围内量效关系明显。柠檬桉叶总黄酮与对照品VC清除DPPH自由基能力较接近，半数抑制量(IC50)值分别为 35.6 μg／mL和24.0 μg／mL。

2.4.2 清除ABTS自由基活性测定[10-11]

以VE为阳性对照，计算样品对ABTS自由基的清除能力。每份样品平行操作3次，取其平均值，按下列公式计算清除率。

式中，Ac为 ABTS自由基溶液的吸光度；Ac为ABTS溶液中加入样品后的吸光度。

结果见图2。可见，柠檬桉叶总黄酮对ABTS自由基具有较好的清除作用，并在试验质量浓度范围内量效关系明显。柠檬桉叶总黄酮比对照品VE清除ABTS自由基的能力弱，IC50值分别为83 μg／mL和32 μg／mL。

3 讨论

正交试验结果表明，柠檬桉叶总黄酮提取的最佳工艺条件，料液比为1∶15（g／mL），提取溶剂为60%乙醇，每次提取1 h，提取3次。工艺验证试验表明，柠檬桉叶总黄酮得率均高于其他各正交试验值，故本最佳工艺条件合理，且工艺重复性和稳定性均较好。

本研究结果显示，柠檬桉叶总黄酮具有较强的清除DPPH自由基能力，在试验质量浓度范围内量效关系明显。总黄酮与对照品VC清除DPPH自由基能力较接近，IC50值分别为35.6 μg／mL和24.0 μg／mL。柠檬桉叶总黄酮具有一定的清除ABTS自由基能力，并在试验质量浓度范围内量效关系明显。总黄酮与对照品VE清除ABTS自由基的 IC50值分别为83 μg／mL和32 μg／mL。

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Extraction Techniques and Free Radical Scavenging Activity of Total Flavonoids from the Leaves of Eucalyptus Citriodora

Lin Sanqing，Zhou Zhongliu，Yang Hongyan，Xia Jingmin，Yang Guizhen，Zhou Liangxia
（School of Chemistry and Chemical Engineering，Lingnan Normal University，Zhanjiang，Guangdong，China 524048）

Objective To study the optimum extraction process of total flavonoids from the leaves of Eucalyptus Citriodora，and to test its scavenging free radical activity.M ethods The orthogonal experiment was used to investigate the effects of ethanol volume fraction，extraction times，ratio of material to liquid and extraction time on the process.The scavenging free radical activity test method was used to remove DPPH and ABTS free radicals as indicators，to evaluate the ability of total flavonoids from the leaves of Eucalyptus Citriodora to scavenge free radicals.Results The optimal extraction conditions of total flavonoids from the leaves of Eucalyptus Citriodora were as follows：60% alcohol as extraction solvent，extraction time 1 h，material to liquid ratio 1∶15，extraction 3 times.Under these conditions，the maximum extraction rate of total flavonoids from the leaves of Eucalyptus Citriodora was 0.312 7%.Conclusion The optimum extraction condition and purification experiment are very useful for further development of industrial process，which may be helpful for further development of Eucalyptus Citriodora as health protection foods.

Leaves of Eucalyptus Citriodora；total flavonoids；extraction；free radical

TQ46；R284.2；R282.71

A

1006-4931(2017)06-0005-04

2016-12-08)

10.3969／j.issn.1006-4931.2017.06.002

国家级星火计划项目[2015GA780041]；广东高校青年创新人才项目；广东省高等学校优秀青年教师培养计划项目[YQ2015109]。

林三清（1983-），男，硕士研究生，实验师，研究方向为天然产物活性成分分离分析，（电子信箱）muqing209＠163.com。

△通讯作者：周中流（1981-），男，博士研究生，副教授，研究方向为天然产物活性成分分离分析与药物创新，（电子信箱）734911896＠qq.com。