张苏，李冀*，杨世林，李笑然，许琼明

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.苏州大学药学院，江苏 苏州 215123)

酸浆苦素抗日本血吸虫作用研究

张苏1，李冀1*，杨世林2，李笑然2，许琼明2

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.苏州大学药学院，江苏 苏州 215123)

目的：考察酸浆苦素(Physalins)对日本血吸虫病的治疗效果。方法：将ICR小鼠随机分为11组，在感染后1天、14天、35天后采用灌胃法给予不同剂量(60，30，15 mg/kg)酸浆苦素治疗，感染后第49天处死小鼠，观察不同给药组小鼠的总虫数、雌虫数、体质量、脾指数及肝脏肉芽肿变化。结果：与对照组相比，在感染日本血吸虫1天给予低剂量酸浆苦素及35天给予高、中、低剂量酸浆苦素能明显降低小鼠体内总虫数及雌虫数(P<0.01)。在感染1天给予酸浆苦素治疗能明显增加小鼠体质量，其中1天中剂量给药组小鼠体质量和脾指数明显降低(P<0.01)。并且，在感染1天给予高、中、低剂量酸浆苦素治疗及35天给予低剂量酸浆苦素能明显降低小鼠肝脏中虫卵肉芽肿的直径，与对照组相比有显著差异(P<0.01)。结论：酸浆苦素对感染早期的日本血吸虫病有一定的治疗效果。

酸浆苦素；日本血吸虫；总虫数；雌虫数；肉芽肿；杀虫效果

血吸虫病是一种严重危害人类健康、影响社会经济发展的人畜共患寄生虫病，在全球76个国家和地区流行[1]，它严重影响着人类的身体健康和国家、地区的经济发展。血吸虫病目前仍然是困扰全球的公共卫生问题，我国是日本血吸虫病流行的主要国家之一[2-3]。长期以来，人们一直在寻找一种能够有效控制并消灭血吸虫的方法，目前而言，血吸虫病的治疗药物仍将会是控制血吸虫病的主要手段[4]。近年来，中草药的抗血吸虫作用的研究在中国已取得一些进展，在抗血吸虫病的工作中起到了一定的辅助作用。如紫草、金银花、板蓝根、防风、五加皮、菊花、正柴胡饮等能明显抑制血吸虫尾蚴钻穿皮肤[5]，并且很多中草药具有逆转肝纤维化、缓解治疗血吸虫病晚期肝硬化腹水等疗效，如中药软肝散结汤治疗血吸虫病肝纤维化患者，具有较好的阻止及逆转肝纤维化和提高血浆白蛋白水平的作用[6]，温阳活血汤配合西药治疗治疗晚期血吸虫病肝硬化患者也具有较好的疗效[7]。

姑娘果(CalyxseuFructusPhysalis)，又叫锦灯笼，始载于《神农本草经》，为茄科多年生草本植物，野生于中国各地，尤为东北最多。据2010年版《中国药典》记载，其味酸、苦，性寒，具有清热解毒、利咽化痰、利尿等作用，临床可用于痰热咳嗽、咽痛音哑、小便不利；外治天疱疮、湿疹[8-9]。国内外研究报道表明，锦灯笼中含有一系列酸浆苦素类化合物及其衍生物[10]，具有抗炎、抗癌和抑菌作用，但其抗日本血吸虫的作用尚未明确。因此，本实验欲探究酸浆苦素的抗日本血吸虫活性。

1 材料

1.1 实验动物与钉螺

ICR小鼠，雌性，6～8 周龄，体质量(25±5)g，由苏州大学实验动物中心提供。所有实验动物均饲养于可控环境中，可自由获取食物水。阳性钉螺购自江苏省血吸虫病防治研究所。

1.2 实验药物

酸浆苦素粉剂，由苏州大学医学部药学院杨世林教授课题组提供。

1.3 仪器

电子天平FA2104S(上海精工产品)；数字式移液器枪(上海Finnpipette Thermo)；Olympus CX31显微镜(Olympus)；高速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；YQ-DSX-280A型压力蒸汽灭菌器(上海中安医疗器械厂)；超低温冰箱(Sanyo产品)；电热恒温培养箱DNP-927(上海精宏实验设备有限公司)；解剖显微镜SZX12(Olympus)。

1.4 试剂

氯化钠、二水合柠檬酸钠、氢氧化钾(KOH)、羧甲基纤维素钠(carboxymethylcellulose sodium,CMC)国药分析纯；0.9%氯化钠注射液(0.9%NS)山东齐都药业有限公司。

2 方法

2.1 小鼠感染模型的建立及分组

采用腹部贴片法感染小鼠，每鼠(60±5)条日本血吸虫尾蚴，感染小鼠随机分为对照组和给药组，每组10只，感染后第49天解剖。1D高中低剂量组分别于感染日本血吸虫后第1天，以60 mg/kg、30 mg/kg、15 mg/kg灌胃，每日1次，连续5天；14D高中低剂量组分别于感染日本血吸虫后第14天，以60 mg/kg、30 mg/kg、15 mg/kg灌胃，每日1次，连续5天；35 D高中低剂量组分别于感染日本血吸虫后第35天，以60 mg/kg、30 mg/kg、15 mg/kg 灌胃，每日1次，连续5天[11]。

2.2 收集虫体，观察杀虫效果

对照组和实验组小鼠均于感染后49天解剖小鼠，仔细检查肝门静脉和肠系膜静脉，收集虫体计数，计算减虫率和减雌率[12-13]。

减虫率(%)=

减雌率(%)=

2.3 酸浆苦素对日本血吸虫感染小鼠体质量和脾指数的影响

将对照组和实验组小鼠于感染后49天(感染日本血吸虫)称取小鼠体质量，剖杀小鼠，摘取脾脏，称重，计算脾指数[14]。

2.4 酸浆苦素对日本血吸虫感染小鼠肝脏病理变化的影响

肝脏置于8%甲醛溶液内固定，组织石蜡切片及苏木素伊红染色(hematoxylin and eosin staining，HE染色)操作观察，测定小鼠肝脏中肉芽肿的平均直径，随机取3个肝脏切片，每张切片随机选取6个视野拍照(×100倍)，通过图像分析软件(ImageJ-NIH，Bethesda)测量肉芽肿的平均直径(μm)。

2.5 统计学分析

3 结果

3.1 酸浆苦素对体内不同发育阶段日本血吸虫的作用结果

感染日本血吸虫后1、14、35D给予60 mg/kg，30 mg/kg及15 mg/kg酸浆苦素，连续5天，灌胃治疗。结果如下：感染血吸虫第1天，高中低剂量组减虫率分别为24.1%、26.5%、33.4%；减雌率分别为29.0%、27.9%、44.0%。感染血吸虫第14天高中低剂量组减虫率分别为27.8%、23.4%、25.1%；减雌率分别为23.3%、22.1%、20.3%。感染血吸虫第35天，高中低剂量组减虫率分别为37.8%、36.0%、36.6%；减雌率分别为48.7%、34.6%、34.6%(见表1)。在感染日本血吸虫第1天对低剂量酸浆苦素及第35天对高、中、低剂量酸浆苦素更为敏感，减虫率及减雌率均较第14天剂量组有所增加。体内不同发育阶段的日本血吸虫对酸浆苦素的敏感程度也具有一定差别，随着发育进程，不同剂量酸浆苦素治疗组小鼠体内总虫数及雌虫数如图所示(见图1、图2)。感染血吸虫后，第1、14、35天给予酸浆苦素各剂量组其总虫数均有明显差异(P<0.05)。感染血吸虫后，第1天和第35天给予酸浆苦素各剂量组其雌虫数均有明显差异(P<0.05)。而感染第1天给予低剂量酸浆苦素以及感染35天给予高、中、低剂量酸浆苦素对日本血吸虫总虫数及雌虫数的降低更为显著(P<0.01)。

表1 不同浓度酸浆苦素对体内不同发育阶段日本血吸虫的作用

图1 不同剂量酸浆苦素对小鼠体内不同发育阶段日本血吸虫作用后的作用效果 注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

图2 不同剂量酸浆苦素对小鼠体内不同发育阶段日本血吸虫作用后的雌虫作用效果 注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

3.2 酸浆苦素对日本血吸虫感染小鼠体质量及脾指数的影响

肝脾肿大是日本血吸虫病的主要特征表现之一，偶见有脾脏寄生虫卵的报道，日本血吸虫可破坏脾脏内的淋巴细胞，前期研究发现酸浆苦素对日本血吸虫造成的脾脏损伤有一定的治疗效果，因此对其展开研究。如图3所示，与未给药的对照组相比，在感染后第1天给予高、中、低剂量酸浆苦素(60 mg/kg，30 mg/kg及15 mg/kg)治疗，小鼠体质量均比对照组有很显著升高(P<0.01)，感染第14天和第35天给予酸浆苦素各剂量组小鼠体质量与对照组无明显差异。与体质量差异趋势相似，感染后第1天给予高、中、低剂量酸浆苦素(60 mg/kg，30 mg/kg及15 mg/kg)治疗，小鼠脾指数相较于对照组均有降低(P<0.05)，其中第1天的中剂量组有很显著的差异(P<0.01)。感染后期其余组别小鼠脾指数比相较于对照组均无明显差异(见图4)。实验结果表明，在感染血吸虫1天后给予酸浆苦素对的小鼠体质量和脾脏有一定的改善作用。

3.3 酸浆苦素对日本血吸虫感染小鼠肝脏病理变化的影响

感染日本血吸虫小鼠不同时期给予不同剂量酸浆苦素治疗后于感染后第49天检测的小鼠肝脏组织的病理学变化，如下图5所示。正常小鼠肝小叶完整，肝细胞呈规则排列，可见中央静脉及放射状肝细胞索。未给药组小鼠肝脏可见明显的虫卵沉积，并有大量淋巴细胞及嗜酸性粒细胞浸润，部分虫卵聚集成簇，肝组织灶性坏死。感染第1天给予酸浆苦素低剂量组小鼠肝脏组织可见少量虫卵沉积，并且给予酸浆苦素治疗后肝细胞呈规则排列形态接近于正常，出现少量炎性细胞浸润的现象。而感染第14天给药组则出现严重的肉芽肿免疫反应。感染第35天给予酸浆苦素治疗后相比于未给药对照组，虫卵较少并且仅汇管大量虫卵沉积，周围有大量淋巴细胞浸润肉芽肿组织增生。实验结果表明，酸浆苦素对由日本血吸虫引起的早期和晚期肝脏病理变化有一定的改善。

由图6可以看出，在第1天给予高、中、低剂量酸浆苦素及第35天给予低剂量组酸浆苦素，均能显著的降低肝脏虫卵肉芽肿的平均直径(P<0.01)。说明酸浆苦素对抗血吸虫病的童虫期疗效显著，对于成虫期也有一定的疗效。

图5 酸浆苦素对感染日本血吸虫小鼠的肝脏肉芽肿形成影响(×100)(N: normal untreated group; NC: Negative control)

图6 酸浆苦素对感染日本血吸虫小鼠的肝脏肉芽肿直径的影响 注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

4 讨论

血吸虫病是由血吸虫成虫寄生于人体所引起的地方性疾病，主要流行于亚、非、拉美的73个国家，据记载，世界上共有76个国家和地区流行这种寄生虫疾病，其中超过2亿人已受感染，近8亿人处在受感染的风险之中。经过多年的积极防治，虽然我国血吸虫病防治工作已取得了一定的成绩，但目前形势仍十分严峻。到了20世纪70年代中期，吡喹酮(praziquantel，PZQ)的问世使血吸虫病化疗达到了一个新的高度[15]。PZQ因其出色的疗效和广泛的适应性在全球范围内成为抗血吸虫病药物的首选(WHO，2002)[16]，具有适应广、疗效高、毒性低、疗程短、给药方便等优点。但随着一种抗蠕虫药物的过度使用，往往会使寄生虫产生一定的抗药性[17]。在血吸虫重度流行区内，PZQ的频繁使用诱导血吸虫产生抗药性的问题已引起了国内外众多研究人员的关注，因此，寻找代替吡喹酮治疗血吸虫病的备选药物亟待解决。

酸浆苦素类化合物是酸浆属植物的主要药用成分，研究表明酸浆苦素类化合物有一定的抗炎作用，但其抗血吸虫作用尚未有研究[18]。在本研究中我们初步探讨了酸浆苦素对日本血吸虫体内发育不同时期的作用，观察到酸浆苦素对小鼠体内不同发育阶段的日本血吸虫有一定程度的杀伤作用。酸浆苦素给药后小鼠体内血吸虫总虫数相较于未给药对照组明显减少，说明其对各种发育阶段的血吸虫均有一定的杀灭作用。其中以1D高中低剂量组给药对于日本血吸虫的效果比较理想，由此可见，酸浆苦素对于日本血吸虫童虫期比较敏感。35D高剂量组减雌率高于减虫率，说明酸浆苦素对成虫期有一定效果。通过HE染色发现，酸浆苦素对肝脏的增殖性肉芽肿有一定的抑制作用，提示酸浆苦素可以拮抗日本血吸虫造成的肝脏损伤，但其确切杀虫和抗炎机制有待于进一步研究。

综上所述，酸浆苦素对日本血吸虫童虫期和成虫期具有一定的杀灭作用且对其产生的肝脏炎症有一定的抑制作用。酸浆苦素有待成为治疗日本血吸虫病的候选药物，尤其是早期感染阶段。

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Antischistosomal Activity of Physalins against Schistosomajaponicum

ZHANG Su1，LI Ji1，YANG Shi-lin2,LI Xiao-ran2,XU Qiong-ming2

(1.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China;2.CollegeofPharmaceuticalSciences,SoochowUniversity,Suzhou215123,China)

Objective: To investigate the effect of Physalins on schistosomiasis. Methods ICR mice were randomly divided into eleven groups. We treated 1-day-old,14-day-old and 35-day-old Schistosoma japonicum infected mice with 60, 30, 15 mg/kg Physalins, respectively, with orally once a day for five consecutive days. The mice were sacrificed on the 49thday of post-infection. Observe the changes of the number of total worms, the number of female worms, body weight, spleen index and granuloma of different groups. Results:Administration of 15 mg/kg Physalins to the 1st day or administration of 60, 30 and 15 mg/kg Physalins to the 35th day post-infected mice could significantly reduce the total worms and female worms compared with those in the control group (P<0.01). Physalins for 1-day-old Schistosoma japonicam infected mice could significantly improve the body weight and reduce the spleen index (P<0.01). In addition, administration of 60, 30 and 15 mg/kg Physalins to the 1st day or administration of 15 mg/kg Physalins to the 35th day post-infected mice could significantly reduce the diameter of granuloma. Conclusion: Physalins has a therapeutic effect on early infectious schistosomiasis.

Physalins; Schistosoma japonicum; Total number of worms; Number of female worms; Granuloma; Schistosomicidal effect

2016-06-24

2016-11-09

张苏(1989-)，女，硕士研究生,主要研究方向：方剂配伍规律及药效物质基础研究。

*通讯作者：李冀(1960-)，男，教授，博士研究生导师，主要从事方剂配伍规律及药效物质基础研究。

R285.5

A

1002-2392(2017)02-0025-04