俞静波，徐 艳，吴 晖，苏为科(.浙江工业大学 绿色制药协同创新中心，浙江 杭州 3004；.杭州中美华东制药有限公司，浙江 杭州 300)

响应面法优化机械辅助提取放线菌肽聚糖

俞静波1，徐 艳1，吴 晖2，苏为科1
(1.浙江工业大学 绿色制药协同创新中心，浙江 杭州 310014；2.杭州中美华东制药有限公司，浙江 杭州 310011)

在单因素实验的基础上，通过响应面分析法对机械球磨辅助提取放线菌发酵菌泥肽聚糖的提取工艺进行优化.实验结果表明：在NaOH质量分数为6%、球料比为15、转速为300 r/min的条件下作用5 min能够有效去除细胞壁表层磷壁酸，并维持其骨架相对完整.与传统方法相比，机械研磨具有时间短、效率高和经济环保的特点.混合物经过十二烷基磺酸钠(SDS)沸水浴30 min和37 ℃胰蛋白酶处理6 h后得到类白色提取物.经溶菌酶酶解实验和红外光谱分析，初步证明该提取物主要成分为肽聚糖.

肽聚糖；球磨；磷壁酸

游动放线菌Actinoplanessp. SE50/110是革兰氏阳性菌，是放线菌中的重要成员，其次级代谢产物阿卡波糖具有很好的降血糖作用[1].肽聚糖为G+菌细胞壁的主要成分，多达30～40层[2].研究表明肽聚糖具有多种生物学活性如抗免疫活性、抗肿瘤及其他活性[3]，在调节宿主免疫功能方面发挥着重要作用.提取菌体细胞壁肽聚糖方法主要包括机械破碎、化学和生物化学渗透及物理渗透[4]等方法.传统化学法常采用三氯乙酸高温处理，破壁效果较好，肽聚糖完整性高，但处理时间长、试剂用量多，且会产生大量废酸.生物化学法利用生物酶破坏细胞壁成分，处理成本相对较高，且效率较低[5].因此，寻找一种高效、低成本，且环境友好的细菌肽聚糖提取方法，不但能够合理获得生物肽聚糖产品，还能降低相关医药生产企业废弃菌泥处理压力，实现高值化利用.

机械球磨具有强烈震动空化效应以及高速搅拌的作用[6]，通过菌体与试剂间的迅速研磨反应，有望达到破坏细胞壁表层磷壁酸，增加细胞通透性的目的，从而获取肽聚糖骨架.采用机械球磨法辅助提取游离放线菌细胞壁肽聚糖，对比化学法确定最佳提取工艺，具有操作简单、效率高、周期短和环境友好等优点，为工业化生产提供新思路.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

游动放线菌Actinoplanessp. SE50/110发酵菌泥，由杭州中美华东制药有限公司提供，胰蛋白酶(Sigma公司)，溶菌酶(Sigma公司)，NaOH、KOH、苯酚、硫酸、三氯乙酸、N-乙酰氨基葡萄糖、对二甲氨基苯甲醛及十二烷基硫酸钠(SDS)等均为国产分析纯试剂.

行星式球磨仪(Restch，PM 200)，低温高速离心机(Sigma，3-18KS)，紫外分光光度计(SHIMADZU，UV1800)，恒温水浴摇床(Julabo，SW22).

1.2 实验方法

1.2.1 放线菌肽聚糖(PG)的提取

菌泥用蒸馏水洗涤至发白，除磷壁酸后收集沉淀，蒸馏水清洗3次.加入8 g/L的SDS沸水浴30 min，离心洗涤沉淀.37 ℃下，加入2 mg/mL胰蛋白酶溶液，于140 r/min下保温6 h.沉淀为PG提取物，用蒸馏水冲洗并于-20 ℃下冷冻保存.

1.2.2 三氯乙酸(TCA)法除去磷壁酸

参照丁喜顺等TCA法[7].不同质量分数的TCA溶液(CTCA)按料液比(质量比)10︰1溶解菌泥(mTCA/m菌泥=CTCA×10)，摇匀后分为3组(20，50，70 ℃)；分别在1，2，3，4，6，8 h取样.每个取样点取样1.5 mL，放入10 mL离心管中，立即离心(8 000 g，20 min，4 ℃)，将上清液放入另一离心管中保存，用于微量磷的测定；沉淀收集物保存用于后续实验.

1.2.3 机械球磨法除去磷壁酸

菌泥与不同质量比(m碱/m菌泥)的碱性试剂置于行星式球磨仪中，在一定转速下反应一定时间后，取菌泥用水溶解，立即离心(8 000 g，20 min，4 ℃)，上清液用于微量磷的测定[8].

1.2.4 上清液中P质量浓度测定

采用磷钼酸法测P质量浓度[9].

1.2.5 N-乙酰氨基葡糖胺(NAG)检测

采用对二甲氨基苯甲醛(PDABA)法检测NGAP[10].肽聚糖是由NAG和N-乙酰胞壁酸(NAM)交替连接的杂多糖与不同组成的肽交叉连接形成的大分子.当肽聚糖结构被破坏时，释放出的NAG.上清液中测得的NAG含量越少，说明细菌细胞壁骨架-肽聚糖结构越完整[11].

1.3 放线菌肽聚糖成分分析

1.3.1 溶菌酶溶解实验

称取一定质量的1.2.1处理后的PG提取物，加入0.1 mol/L的磷酸缓冲液(pH=6.2)中，配制成1 mg/mL的溶液，加入适量蛋清溶菌酶，质量浓度为200 μg/mL.样品于37 ℃，120 r/min恒温摇床振荡处理24 h，于450 nm下检测吸光值随时间变化的情况[11].

1.3.2 红外光谱分析

取适量肽聚糖提取物用KBr压片，傅利叶变换红外光谱分析仪进行红外光谱分析[12]，扫描范围4 000～800 cm-1.

2 结果与讨论

2.1 TCA法除磷壁酸实验考察

2.1.1 TCA用量对磷壁酸去除效果考察

分别选择5%，10%，15%的TCA溶液，与菌泥以10∶1混匀，70 ℃下水浴2 h，上清液进行P质量浓度测定.

由图1(a)可知：TCA质量分数越大，上清液中P质量浓度越高，10%与15%的TCA溶液相比，测得P质量浓度相差较小，故选择10%的TCA质量分数(mTCA/m菌泥=1)进行温度和时间的考察.

2.1.2 TCA作用不同温度、时间对磷壁酸去除效果考察

10%的TCA溶液与菌泥以10∶1混匀后，分别在20，50，70 ℃下作用1，2，3，4，6，8 h，观察其P质量浓度的变化.

由图1(b)所示，在不同温度下随着作用时间的增加所释放的P质量浓度均随之增加，70 ℃下作用4 h后进入平台期，P质量浓度达到405.24 mg/L；50 ℃下同样作用4 h后进入平台期，但P质量浓度较70 ℃低，P质量浓度达到356.42 mg/L；20 ℃下进入平台期时间相对较早，仅需2 h，但释放的P质量浓度远低于其他温度，只有265.58 mg/L.因此，优选的TCA作用温度为70 ℃，作用时间为4 h.在此条件下测得NAG的质量浓度为125.91 mg/L.

图1 TCA不同用量及作用时间、温度对磷壁酸去除效果考察Fig.1 Influence of the amount of TCA, time and temperature on the removal of Teichoic acid

2.2 机械球磨辅助提取单因素实验结果

2.2.1 碱类别对磷壁酸去除及肽聚糖的破坏作用考察

取4 g菌泥分别与质量分数为0，3%，6%的NaOH、KOH固体混合均匀，在球料比为15，250 r/min条件下，球磨15 min.球磨混合物用等体积水溶解后取样1.5 mL，放入10 mL离心管中，立即离心(8 000 g，20 min，4 ℃)，将上清液放入另一离心管中保存，用于微量磷、NAG的测定.结果如图2(a)所示，三种固料比下，NaOH作用效果均优于KOH，两者对肽聚糖完整性破坏效果相差不大(图2b)，故选择NaOH作为反应试剂.

图2 机械球磨时碱类别对磷壁酸去除及肽聚糖破坏作用考察Fig.2 Influence of base type on the removal of Teichoic acid and PG breaking

2.2.2 碱用量对磷壁酸去除及肽聚糖破坏作用考察

取4 g菌泥分别与质量分数为0，3%，6%，9%，12%，15%的NaOH固体混合均匀，在球料比为15，250 r/min条件下，球磨15 min.球磨混合物用等体积水溶解后取样1.5 mL，放入10 mL离心管中，立即离心(8 000 g，20 min，4 ℃)，将上清液放入另一离心管中保存，用于微量磷、NAG的测定.结果如图3(a)所示，随着NaOH用量增加，P质量浓度也相应提高，碱用量超过9%时P释放趋于平缓，而NAG的释放则随碱用量的增加呈上升趋势.

图3 机械球磨时碱用量及球磨时间对磷壁酸去除及肽聚糖破坏作用考察Fig.3 Influence of amount of NaOH on the removal of Teichoic acid and PG breaking

2.2.3 球磨时间对磷壁酸去除及肽聚糖破坏作用考察

取4 g菌泥与质量分数为9%的NaOH固体混合均匀，在球料比15，及250 r/min转速下，分别球磨5，10，15，20，25 min.球磨混合物用等体积水溶解后取样1.5 mL，放入10 mL离心管中，立即离心(8 000 g，20 min，4 ℃)，将上清液放入另一离心管中保存，用于微量磷、NAG的测定.结果如图3(b)所示，球磨时间对P质量浓度的影响不大，总体呈平缓趋势；对于NAG含量影响较明显，时间越长，NAG释放量增多.因此选择球磨时间为5 min.

2.2.4 球磨转速对磷壁酸去除及肽聚糖的破坏作用考察

取4 g菌泥与质量分数为9%的NaOH固体混合均匀，在球料比为15，转速为100，150，200，250，300 r/min下分别球磨5 min.球磨混合物用等体积水溶解后取样1.5 mL，放入10 mL离心管中，立即离心(8 000 g，20 min，4 ℃)，将上清液放入另一离心管中保存，用于微量磷、NAG的测定.结果如图4(a)可知：P和NAG质量浓度均随转速的提升而增加.当转速大于250 r/min时，P质量浓度上升趋于平缓，但NAG质量浓度显著增加.

图4 机械球磨时转速及球料比对磷壁酸去除及肽聚糖破坏作用考察Fig.4 Influence of rotating speed on the removal of Teichoic acid and PG breaking

2.2.5 球料比对磷壁酸去除及肽聚糖破坏作用考察

取4 g菌泥与质量分数为9%的NaOH固体混合均匀，在球料比为9，12，15，18，21，转速为250 r/min下分别球磨5 min.球磨混合物用等体积水溶解后取样1.5 mL，放入10 mL离心管中，立即离心(8 000 g，20 min，4 ℃)，将上清液放入另一离心管中保存，用于微量磷、NAG的测定.结果如图4(b)所示，P及NAG质量浓度均随着球料比的提升而增加，在18时达到峰值，继续提升球料比则两者均明显下降.

2.3 响应面结果和分析

2.3.1 建立与分析回归模型

根据Box-Behnken实验设计原理，再结合单因素实验结果，选择加碱量、球磨转速和球料比进行三因素三水平中心组合实验(表1)，P质量浓度及NAG释放量为响应值，利用Design-expert软件进行响应面分析[13]，确定机械球磨法去除菌渣磷壁酸获取肽聚糖的最佳工艺参数，实验结果见表2.

表1 响应面三因素三水平实验设计

Table 1 The experimental design of 3 factor and 3 level of response surface method

水平因素A球磨转速X1/(r·min-1)因素B加碱量X2/%因素C球料比/(g·g-1)-1200615025091813001221

对实验数据进行回归拟合，得P质量浓度Y1，NAG质量浓度Y2对于因素A，B，C的回归方程如下：

Y1=772.25+71.00X1+34.83X2+5.77X3- 43.17X1X2-10.20X1X3-3.57X2X3- 82.25X1X1-59.51X2X2-31.94X3X3

(1)

Y2=3.81+0.36X1+0.19X2+0.36X3+ 0.27X1X2+0.19X1X3-0.020X2X3- 0.24X1X1-0.41X2X2+0.053X3X3

(2)

利用F检验和P值对该模型的方差分析见表3.由表3中各模型的P值可知：式(1)中一次项转速为极显著因素，加碱量为显著因素，球料比为不显著因素；式(1)中大部分二次项是显著因素，表明P质量浓度对各影响因素不是简单的线性关系[14-15].式(2)中一次项转速和球料比是极显著因素，二次项中大部分都不是显著因素.F值检验表明：该模型为极显著(P<0.001).表明可以用该数学模型对机械球磨去除磷壁酸实验结果及最优条件进行分析预测.

表2 响应面分析实验及结果1)Table 2 Program and experimental results of RSA

注：1) 表中数据为3次重复试验的平均值.

表3 回归方程各项的方差分析表1)Table 3 Variance analysis of regression equation

注：1)*表示显著；**表示极显著.

2.3.2 磷壁酸去除工艺响应面分析与优化

图5为P质量浓度响应面曲面图，图6为NAG质量浓度响应面曲面图.曲面越陡，其影响更显著.从图5(a～c)可看出：对P质量浓度影响程度由高到低依次为转速、碱量及球料比；从图6(a～c)可看出：对NAG质量浓度影响程度由高到低依次为转速、球料比及加碱量[16].从立体图看：存在极值的条件应该在圆心处.为了进一步确定最佳值，根据对响应面图的分析及Design-Expert软件的优化分析，选择P质量浓度最大化、NAG质量浓度最小化，得到最佳提取条件：转速300 r/min，加碱量6%，球料比15.707.在该条件下P质量浓度理论值为432.39 mg/L，NAG质量浓度为118.96 mg/L.考虑到实际操作将最佳工艺参数修改为：转速为300 r/min，加碱量为6%，球料比为15.以上述条件进行磷壁酸去除试验验证，取三次平行试验，实际P质量浓度为433.72 mg/L，NAG释放量为120.07 mg/L，实验结果与模型符合良好，说明该模型能够较好的模拟和预测磷壁酸的去除量.

图5 各因素对磷壁酸去除效果的交互影响曲面图Fig.5 Responsive surfaces of interactive effects on removal of Teichoic acid

图6 各因素对肽聚糖破坏效果的交互影响曲面图Fig.6 Responsive surfaces of interactive effects on PG breaking

2.4 传统法与球磨法比较

传统法与球磨法比较如表4所示.

表4 传统法与机械球磨法对放线菌磷璧酸去除及肽聚糖破坏作用的比较

Table 4 Comparison between conventional methordandmechanochemical extraction on the removal of Teichoic acid and PG breaking

项目传统法机械球磨法反应剂用量与菌料质量比/(g·g-1)1∶10.06∶1.00反应时间/min2405反应温度/℃7025上清液P质量浓度/(mg·L-1)405.24433.72上清液NAG质量浓度/(mg·L-1)125.91120.07

2.5 放线菌肽聚糖的鉴定

2.5.1 溶菌酶溶解实验

溶菌酶是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶，它能专一切断肽聚糖中NAG和NAM之间β-1,4糖苷键，通过破坏肽聚糖骨架使肽聚糖溶解.溶菌酶酶解实验常用于肽聚糖的定性鉴定，如图7所示.

图7 溶菌酶处理对肽聚糖提取物溶解性的影响Fig.7 Influence of lysozyme on the solubility of PG extracts

由图7可以看出：随着溶菌酶酶解时间的增加，溶液吸光值逐渐降低，在消化过程中的最初10 h内吸光值呈现下降趋势，随后平稳，而未加溶菌酶的对照组吸光值一直呈平稳趋势，说明提取物可以被溶菌酶消化降解，证明提取物主要成分为肽聚糖.

2.5.2 红外光谱图

肽聚糖提取物的红外光谱(图8)与文献[12]报道符合.放线菌肽聚糖提取物在1 200～1 000 cm-1的两个峰为吡喃糖环C—O—C的伸缩振动峰和O—H的变角振动峰.1 539.46 cm-1处为N—H的变角振动峰.1 652.16 cm-1处为CH3CONH-的特征吸收峰.此外，3 500～3 200，3 000～2 800，1 400～1 200 cm-1这几处均含有糖类物质的特征吸收峰.

图8 肽聚糖提取物红外光谱分析Fig.8 FTTR analysis of peptidoglycan

3 结 论

采用的机械球磨辅助提取游离放线菌发酵菌泥肽聚糖方法与传统三氯乙酸法相比，仅用少量的无机碱替代具有刺激性的有机酸(TCA，mTCA/m菌泥=1)，实现磷壁酸的高效去除，大大降低成本，缩短处理时间，减少废酸排放.通过响应面优化研究，得到肽聚糖提取的最优工艺参数：加碱量(m碱/m菌泥=0.06)，球料比为15，转速为300 r/min；在此条件下反应5 min，磷壁酸去除率(以P质量浓度计)为433.72 mg/L，细胞壁骨架破坏率(以NAG质量浓度计)为120.07 mg/L.溶菌酶酶解实验和红外光谱分析初步确认提取物的主要成分为肽聚糖.

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(责任编辑：陈石平)

Study on optimizing mechanochemical extraction of peptidoglycan fromActinoplanessp.by RSM

YU Jingbo1, XU Yan1, WU Hui2, SU Weike1
(1.Collaborative Innovation Center of Green Pharmaceuticals, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China; 2.Hangzhou ZhongmeiHuadong Pharmaceutical Co., Ltd., Hangzhou 310011, China)

Based on the single factor tests, the response surface methodology(RSM) was used for optimizing mechanochemical extraction processing of peptidoglycan fromActinoplanessp. SE50/110. The results showed that the optimum millingcondition was as follows: NaOH(6%), ball to power weight ratio(15), rotating speed(300 r/min). After treated for 5 minutes under the above condition, most of the lipoteichoic acid was removed to release large amount of P with relatively intact cell wall skeleton.Compared to conventional method, the mechanochemical extraction wasmore efficient,economic and environmentally friendly.After the boiling bath with 8 g/dL SDS for 30 min, the residues were incubated in PBS(50 mmol/L, pH 6.8)containing 2 000 U trypsin at 37 ℃ for 6 h to afford off-white solid. The main content of the extract was preliminary confirmed to be peptidoglycan by lysozyme hydrolysis and FTTR analysis.

peptidoglycan; ball milling; Teichoic acid

2016-06-15

国家自然科学基金资助项目(21406201)；2015浙江省博士后科研项目择优资助(BSH1502012)

俞静波(1985—)，女，浙江杭州人，讲师，研究方向为药物绿色制备技术及机械化学反应技术，E-mail：yjb@zjut.edu.cn.

TQ033

A

1006-4303(2017)02-0210-07