陈义坤，罗诚浩，魏敏，李冉，岳海波，郭国宁

（湖北中烟工业有限责任公司技术中心，湖北武汉430040）

微生物转化对山楂提取物挥发性香气成分的影响

陈义坤，罗诚浩，魏敏*，李冉，岳海波，郭国宁

（湖北中烟工业有限责任公司技术中心，湖北武汉430040）

为了研究食甲醇芽孢杆菌（Bacillusmethylotrophicus）J4-1生物转化对山楂提取物挥发性成分的影响，采用同时蒸馏萃取、GC/MS对比分析经回流提取后由J4-1转化的山楂提取物和对照的挥发性成分。结果表明：①微生物转化山楂提取物鉴定出58种挥发性成分，新增35种，包括己酸、乙酸己酯、丁酸己酯、松油醇、二氢猕猴桃内酯、光黄素等，占总相对百分含量21%以上；对照样品鉴定出34种挥发性成分；②相对百分含量显著增加的有己醛、糠醛、葵醛、棕榈酸乙酯、柠檬酸三丁酯等15种，刺激性成分如邻苯二甲酸异丁酯、邻苯二甲酸单（2-乙基己基）酯显著降低，14种挥发性成分消失。经微生物转化的山楂提取物挥发性成分改变大，具有酸甜、奶香丰富香气，刺激性成分减少，香气质提高。

食甲醇芽孢杆菌（J4-1）；微生物转化山楂提取物；GC/MS；挥发性香气成分

山楂（Crataegus pinnatifida Bunge），又名山里红、山里果，核果类水果，核质硬，果肉薄，味微酸涩。山楂具有较高的营养价值和药用价值，富含VC、多糖、有机酸、黄酮等多种营养物质及矿质元素，具有降血脂、保肝、降压、助消化、抗菌等功效[1]，对高血压、糖尿病、冠心病、心绞痛等均具有辅助治疗作用[2]，除药用外，2012年国家食品药品管理局已经将其纳入保健食品原料在征询意见，表明应用范围的扩展[3]。目前，有关山楂的研究报道主要集中在它的化学成分[4-6]、黄酮类生物活性方面[7-8]、对山楂挥发性成分的提取与鉴定[9-13]，而生物技术制备天然山楂香料的化学成分分析[14]相关报道较少。本实验研究微生物转化对山楂挥发性成分的影响，还鲜见报道，旨在为山楂进一步开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

食甲醇芽孢杆菌Bacillusmethylotrophicus（J4-1）：从武汉健民制药厂土壤中筛选得到，于2012年1月11日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心；斜面培养基（马铃薯葡萄糖琼脂培养基，BR）（马铃薯浸液200mL/L、葡萄糖20 g/L、琼脂13 g/L）、原始种子培养基（麦芽糖蛋白胨培养基）（麦芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5 g/L）：北京三药科技开发公司；葡萄糖、琼脂、麦芽糖、蛋白胨、氯化钠、二氯甲烷、无水硫酸钠、95%乙醇：国药集团化学试剂有限公司，AR；马铃薯：市售；发酵底物为山楂提取物：市售鲜山楂（产地河北）。

SHP-080生化培养箱：上海精宏实验设备有限公司；YX.350Z灭菌锅：上海三申医疗器械有限公司；SW-CJ-1FD超净工作台：苏净集团安泰公司；HQL 300B恒温摇床：武汉中科科仪技术发展有限责任公司；Agilent6890N/5973型气相色谱质谱联用仪：安捷伦科技公司。

1.2 方法

1.2.1 微生物转化制备山楂提取物

用接种环挑取一环J4-1到装有200mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，30℃，150 r/min培养36 h。将破碎山楂果实和水按质量比1∶30混合，回流提取3 h后，抽滤，取滤液，115℃灭菌25min；将产香菌J4-1接种到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，在恒温培养箱中32℃、pH值自然，静置培养72 h后置于4℃冰箱中；用上述斜面培养物，接种到种子培养基，在32℃，转速120 r/min条件下振荡培养24 h，连续转接2次后制得种子培养液；将种子培养液按体积比10%接种到山楂滤液中，装罐量为15%，在pH自然，温度32℃，转速120 r/min，不避光条件下，发酵36 h，得到山楂发酵液，抽滤浓缩得到相对密度约为1.3的浸膏，与95%乙醇按质量比1∶3进行醇沉，过夜后抽滤，除去杂质保留滤液，并减压浓缩除去溶剂，制得红褐色浸膏，密度约为1.12左右，为微生物转化山楂提取物。

1.2.2 挥发性香气成分GC/MS分析

1.2.2.1 同时蒸馏萃取

将5 g微生物转化山楂提取物装入圆底烧瓶中，加入400mL水，用电热套加热至沸腾，另一侧的圆底烧瓶中加入200mL的二氯甲烷，60℃水浴沸腾，待中间分液管处液面出现分层后计时萃取2 h。萃取结束后，向二氯甲烷萃取液中加入无水硫酸钠，过夜，过滤并浓缩至1mL，浓缩液用于进行GC/MS分析。同样的方法进行5 g未生物转化山楂提取物，同时蒸馏萃取后作为对照样，进行GC/MS分析。

1.2.2.2 GC/MS分析

HP-5MS（50m×0.25mm×0.25μm）毛细管柱；进样温度：250℃；分流比20∶1；载气：He，1mL/min；升温程序：从50℃（1min）以5℃/min升到250℃（5min）；传输线温度：250℃；离子源：EI源；电子能量：70 eV；扫描范围：50 amu～400 amu；使用WILEY和MINILAB谱库进行检索。

2 结果与分析

微生物转化山楂提取物及其对照的挥发性香气成分GC/MS分析结果见表1。

表1表明：①山楂提取物对照共分离鉴定出34种挥发性香气成分，主要包括醇类、酮类、酯类、酸类、吡喃等其他杂环化合物；②产香菌生物转化山楂提取物共分离鉴定出58种香气成分，新出现了35种香气成分，新增35种，包括己酸、乙酸己酯、丁酸己酯、松油醇、二氢猕猴桃内酯、光黄素等，占总相对百分含量21%以上，其中己酸为低级脂肪酸、挥发性有机酸，挥发到空气中给予醇和气息；乙酸己酯具有果香气；丁酸己酯呈青香、果香、酯香、蔬菜香及强烈的混合水果香气和菠萝香昧；松油醇似松针香气，挥发到空气中能增加青香；二氢猕猴桃内酯，带有香豆素样香气，并有麝香样气息；对照样品鉴定出34种挥发性成分；②相对百分含量显著增加的有己醛、糠醛、葵醛、棕榈酸乙酯、柠檬酸三丁酯等15种，其中己醛呈生的油脂和青草气及苹果香味；糠醛具有杏仁香带焦香；棕榈酸乙酯是高级饱和脂肪酸，呈微弱蜡香和奶油香气，挥发到空气中具有柔和香气的作用。而刺激性成分如邻苯二甲酸异丁酯、邻苯二甲酸单（2-乙基己基）酯显著降低，14种挥发性成分消失，其中的有害刺激性成分，在热裂解过程中容易形成强烈刺激性和杂气物质，增加对喉部的刺激性和粗糙感，它们的含量经发酵后显著降低或消失，可能是因为经过微生物酶体系作用而分解、降解、转化，有利于山楂香气品质的提高。有上述可知，经微生物转化的山楂提取物挥发性成分改变很大，具有酸甜、奶香等丰富香气，刺激性成分减少，香气质提高。

表1 微生物转化山楂提取物与其对照的挥发性香气成分GC/MS差异分析Table1 GC/MSdifferenceanalysisof volatilearoma componentsof biotransformated haWthorn extractand its control

续表1 微生物转化山楂提取物与其对照的挥发性香气成分GC/MS差异分析Continue table1 GC/MSdifferenceanalysisof volatilearom a componentsof biotransformated haWthorn extractand its control

续表1 微生物转化山楂提取物与其对照的挥发性香气成分GC/MS差异分析Continue table1 GC/MSdifferenceanalysisof volatilearom a com ponentsof biotransformated haWthorn extractand its control

3 结论

食甲醇芽孢杆菌（Bacillusmethylotrophicus）J4-1生物转化山楂提取物后，对其挥发性成分影响较大，新增和消失成分种类较多，相对百分含量变化也大，赋予了微生物转化山楂提取物酸甜、奶香等丰富香气，减少刺激性成分，提高了香气质，旨为山楂进一步开发利用提供参考。

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Influence of Biotransformation on the Volatile Arom a Com ponents of HaWthorn Extract

CHENYi-kun，LUOCheng-hao，WEIMin*，LIRan，YUEHai-bo，GUOGuo-ning
（Technology CenterofChina Tobacco Hubei Industry Limited-liability Company，Wuhan 430040，Hubei，China）

To Study the influence ofbiotransformation on the volatile components of hawthorn extract，the constituents in the biotransformed hawthorn extract and its contrastwere analyzed by GC/MS after simultaneous distillation.Results：①58 volatile componentswere identified from the biotransformed hawthorn extract，including 35 kinds of new：hexanoic acid，acetic acid ester，hexyl butyrate，terpinol，dihydroactinidiolide，lumiflavine，etc.，which accounted for21%of the total volatile componentsof thebiotransformed hawthorn extract；and 34 kinds of volatile componentswere identified from the control samples；②15 kinds of volatile components'relative percentage content increased significantly，including hexanal，furfural，decanal，hexadecanoic acid，ethyl palmitate，tributyl citrate，etc.；Irritating ingredients such as 1，2-Benzenedicarboxylic acid，butyl 2-methylpropylester and 1，2-Benzenedicarboxylic acid，mono（2-ethylhexyl）ester decreased significantly；14 kindsofvolatile componentsdisappeared.Afterbiotrasformation，the volatile componentsofhawthorn extract has changed greatly，with sweet and sour，milk fragrance rich aroma，and stimulating ingredients reduce、improving the quality ofaroma.

Bacillusmethylotrophicus（J4-1）；biotransformed hawthorn extract；GC/MS；volatile aroma components

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.07.033

2016-07-18

陈义坤（1975—），男（汉），工程师，博士，研究方向：天然香料开发。

*通信作者：魏敏（1979—），女（汉），高级工程师，硕士，研究方向：生物技术开发天然食品添加剂。