韩荣伟，于忠娜，刘璐，王军，*

（1.青岛农业大学食品科学与工程学院，山东青岛266109；2.青岛农业大学海都学院，山东莱阳265200）

响应面法优化直投式酸奶发酵剂的工艺研究

韩荣伟1，于忠娜2，刘璐1，王军1，*

（1.青岛农业大学食品科学与工程学院，山东青岛266109；2.青岛农业大学海都学院，山东莱阳265200）

直投式酸奶发酵剂因活性高、稳定性好、使用简便，已成为酸奶发酵剂的主要发展方向。嗜热链球菌（Streptococcusthermophilus，St）和保加利亚乳杆菌（Lactobacillusbulgaricus，Lb）经活化和纯化后，以存活率为指标，对混合发酵液的菌种混合比例、离心条件、预冻条件进行单因素试验。试验结果表明混合发酵液的最佳制备条件为：St∶Lb=1∶1（体积比）、离心速度3000 r/min、离心时间10min、预冻温度-80℃、预冻时间1 h；采用响应面法对冻干菌悬液的保护剂pH、保护剂和菌泥平衡时间、保护剂和菌泥混合比例进行优化试验，结果表明冻干菌悬液最佳制备条件为：保护剂pH6.6、平衡时间30min、保护剂和菌泥混合比例2∶1（mL/g），此时St存活率63.77%、Lb存活率66.03%，具有较好的市场前景和应用价值。

嗜热链球菌；保加利亚乳杆菌；直投式酸奶发酵剂；响应面法

酸奶发酵剂是酸奶生产中至关重要的一部分，酸奶发酵剂的发酵性能直接关系到酸奶的品质和质量。酸奶发酵剂一般都是由嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus，St）和保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus，Lb）两种菌组成[1-3]。将保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌进行组合制备直投式酸奶发酵剂，可以发挥不同优良菌株的发酵性能，从而使得酸奶发酵剂同时具备发酵速率快、发酵产品黏度好、特征风味浓郁、保健功能良好等优良性能[4-7]。我国在冻干发酵剂的研制方面起步较晚，国内现阶段使用的酸奶发酵剂大多是从国外进口。基于此，本文研究通过响应面方法研究了直投式保加利亚乳杆菌—嗜热链球菌复合发酵剂制备过程中混合发酵液及冻干菌悬液的制备条件，从而制备出一种高活性的直投式酸奶发酵剂。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌：台湾亚芯生物科技有限公司；奶粉：伊利脱脂奶粉；氯化钠、葡萄糖、乳糖、柠檬酸二铵、硫酸镁、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸锰：莱阳市康德化工有限公司；乙酸钠：天津市瑞金特化学品有限公司；吐温-80：天津市富宇精细化工有限公司；胰蛋白胨、牛肉膏酵母浸粉、中性红：北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.2 仪器与设备

Alpha 1-2 LD plus真空冷冻干燥机：德国CHRIST公司；Seven-Multi型pH/电导率/离子综合测试仪：梅特勒-托利多公司；AR224CN电子天平：奥豪斯仪器上海有限公司；SW-CJ-1F超洁净工作台：苏州智净净化设备有限公司；TGL-16C台式离心机：上海安亭电子仪器厂。

1.3 试剂配制

培养基及缓冲液磷酸缓冲液、10%脱脂乳培养基、MC培养基及MRS培养基均按文献中配方配制[8-12]。

1.4 方法

菌种活化→制备混合发酵液→离心混合发酵液→加入保护剂→预冻→真空冷冻干燥→获得发酵剂

1.5 菌种活化

称取St、Lb菌粉各1 g分别加入盛有9mLMC、MRS无菌液体培养基中，混合均匀后37℃恒温培养24 h。取MC、MRS菌悬液各0.1mL涂布于MC、MRS固体培养基上，37℃培养48 h，然后挑取St、Lb的单个菌落分别接种于10mLMC、MRS无菌液体培养基中，37℃培养24 h，获得St、Lb菌悬液，备用。

1.6 混合发酵液处理条件的单因素试验

1.6.1 混合发酵液的制备

将St和Lb分别按照活菌数1∶1、1∶2、2∶1的比例（体积比）接种于MRS培养基中，37℃培养，10 h后每2 h添加一次缓冲液，添加量均为1%（体积比）[12]，培养至16 h取出，获得混合发酵液。然后分别进行菌落计数。

1.6.2 混合发酵液离心条件的确定

制备混合发酵液，在2 000、3 000、4 000 r/min条件下分别离心10、15、20min，取上清液和菌泥分别进行活菌计数，计算出菌泥获得率和离心存活率。

式中：X为离心存活率，%；N1为初始活菌数，cfu/mL；N2为菌泥活菌数，cfu/mL；N3为上清液活菌数，cfu/mL。

式中：M为菌泥获得率，%；m1为离心后离心管总重，g；m2为离心管空重，g；m3为终止培养时培养物和离心管总重，g；m4为干离心管空重，g。

1.6.3 保护剂的加入

加入保护剂后可以使保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌保持稳定的活性，减弱真空冷冻干燥过程中对两种菌的破坏。本试验选取10%的脱脂乳作为冻干保护剂[8]。

1.6.4 预冻温度和预冻时间的确定

菌泥均匀混合等量10%脱脂乳，在-20、-80℃条件下预冻不同的时间1、3、5 h后，将完全冻结的样品取出，采用平板计数法进行菌落计数。检测预冻前后的活菌数，计算两种菌的预冻存活率。

式中：Y为预冻存活率，%；N4为预冻后活菌数，cfu/mL；N5为预冻前活菌数，cfu/mL。

1.7 真空冷冻干燥

开启真空冷冻干燥机待温度降到-56℃后进行1 h预热。将经过1.6.4中确定的预冻温度和预冻时间处理过的完全冻结的菌悬液，进行真空冷冻干燥[13]。

1.8 冻干菌悬液制备条件的单因素试验

1.8.1 保护剂的pH值的确定

调节冻干保护剂（10%脱脂乳）的pH值为6.0、6.5、7.0、7.5。在室温下将菌泥与等量的冻干保护剂混合均匀后，平衡30min，进行真空冷冻干燥。

1.8.2 保护剂和菌泥的平衡时间的确定

在室温下将菌泥与等量的冻干保护剂混合均匀后，在冻干保护剂pH值6.5条件下分别平衡20、30、40、50min，进行真空冷冻干燥。

1.8.3 保护剂与和菌泥混合比例的确定

在室温下将冻干保护剂与菌泥按1∶1、2∶1、3∶1、4∶1（mL/g）比例混合均匀后，在冻干保护剂pH值6.5条件下平衡30min，进行真空冷冻干燥。

1.9 菌落计数

将真空冷冻干燥后得到的菌粉在无菌条件下，用无菌生理盐水将其在室温下进行复水操作。平板计数法检测真空冷冻干燥前后两种菌的活菌数，然后计算出两种菌的冻干存活率。

1.10 响应面设计

依据单因素试验结果，以保护剂的pH（A）、保护剂和菌泥的平衡时间（B）、保护剂和菌泥的混合比例（C）3个因素作为自变量，以保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的存活率（Y1、Y2）作为响应值进行响应面优化设计试验。根据Box-Behnken试验设计原理[14]，通过Design-Expert8.0对试验数据进行分析，确定冻干菌悬液的最佳制备工艺条件。

2 结果与分析

2.1 离心条件对混合发酵液中菌落存活率的影响

离心转速和时间对St、Lb存活率的影响见表1。

表1 离心转速和时间对St、Lb存活率的影响Table1 Effectof centrifugalspeed and timeon survival rateof St&Lb

由表1可知，经过离心后Lb存活率在75%以上的有4、5、6、7，St存活率在75%以上的有3、4、5，为了同时保证两种菌的高存活率试验方案4、5较理想，其菌泥获得率分别为1.23%、1.36%。从节约能源、提高生产效率、降低生产成本方面考虑，选择3 000 r/min、10min作为该试验的最佳离心条件。

2.2 预冻温度和预冻时间对混合发酵液中菌落存活率的影响

预冻温度和时间对St、Lb存活率的影响见图1。

图1 预冻温度和时间对St、Lb存活率的影响Fig.1 Effectsof p refreezing temperatureand freezing tim eon the survival rateof St&Lb

由图1可知，-20℃下预冻5 h和-80℃预冻1h条件下两种菌的存活率都达到75%以上；这可能是因为-80℃条件下，冷冻可以快速通过最大冰晶生成区，可以形成大量小的稳定冰晶体[15]。所以选择预冻温度-80℃、预冻时间1 h作为两种菌的最佳试验条件。

2.3 冻干菌悬液制备条件对St、Lb存活率的影响

2.3.1 St、Lb混合比例对其存活率的影响

St和Lb混合比例对其存活率的影响见表2。

表2 St和Lb混合比例对其存活率的影响Table2 Effectsof St&Lbm ixture ratio on their survival rate

根据表2数据可以看出St与Lb按活菌数为1∶1（体积比）混合时，两种菌的存活率最高。所以将St：Lb=1∶1（体积比），作为本试验两种菌的混合比例。

2.3.2 保护剂pH对St、Lb存活率的影响

保护剂pH对St、Lb存活率的影响见图2。

图2 保护剂pH对St、Lb存活率的影响Fig.2 Effectof protectiveagent pH on the survival rateof St&Lb

由图2可知，两种菌的存活率随着保护剂pH的增大先上升后下降，且在pH值为6.5时，两种菌的存活率达到最高值。这也说明保护剂的pH只是在某个特定范围值内，才会在真空冷冻干燥过程中对保加利亚杆菌和嗜热链球菌的存活起到保护作用，pH过高或者过低都会使两种菌的存活率降低。pH值为6.5时为最优条件。

2.3.3 保护剂和菌泥的平衡时间对St、Lb存活率的影响

图3保护剂和菌泥的平衡时间对St、Lb存活率的影响见图3。

图3 保护剂和菌泥的平衡时间对St、Lb存活率的影响Fig.3 Effectsof thebalance timeof the protectiveagentand the bacterialsludgeon the survival rateof St&Lb

根据图3可以看出，保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的存活率都随着平衡时间的延长先上升后下降，并且在平衡时间为30min时，存活率达到最大值。这可能是因为平衡时间太短，会使保护剂无法充分扩散至两种菌中，从而导致保护剂无法对两者菌达到最佳的保护效果；平衡时间过长，护剂不但不会起到保护作用，可能还会对两种菌的存活起到抑制作用[16]。

2.3.4 保护剂和菌泥混合比例对St、Lb存活率的影响

保护剂和菌泥混合比例对St、Lb存活率的影响见图4。

图4 保护剂和菌泥混合比例对St、Lb存活率的影响Fig.4 Effectsofm ixed proportion of protectiveagentsand bacterialsludgeon the survival rateof St&Lb

根据图4可以看出，保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌都是随着保护剂与菌泥混合比例的增加，先上升后下降，在保护剂：菌泥的混合比例为2∶1（mL/g）时，两种菌的存活率达到最大值。这可能是由于混合比例的增大，使得有足够的保护剂能够充分扩散到两种菌中，确保细胞被充分的保护，达到良好的保护效果。

2.4 响应面优化试验设计和结果分析

2.4.1 响应面优化试验设计和结果

根据单因素试验结果，响应面优化试验设计及结果见表3、表4。

表3 响应面优化试验因素水平表Table3 Factorsand levelsused in response surfacedesign

表4 Box-Behnken试验设计及结果Table4 Box-Behnken design With experimental results for sterilization efficiency

2.4.2 各因素对St存活率的响应面优化试验和分析

本试验对保护剂pH值、保护剂和菌泥平衡时间、保护剂和菌泥混合比例3个因素，及3个因素的交叉作用对St存活率的影响进行研究，结果如表5所示。

表5 响应面试验结果方差分析Table5 Analysisof variance for the fittedmathematicalmodel

续表5 响应面试验结果方差分析Continue table5 Analysisof variance for the fittedm athematical model

根据表5可以看出，模型的P值＜0.000 1，这说明该模型极显著，即该试验方案具有可靠性。失拟项P= 0.187 2＞0.05，说明没有失拟因素存在，回归方程具有较好的拟合性，该模型能模拟A、B、C 3个因素对St菌种存活率的影响。B、C的P值均＜0.000 1，A的P= 0.003 8＜0.005，所以B、C对St存活率的影响是极显著的，A对St存活率是显著的；AB（P=0.0448）、AC（P= 0.005 1）、BC（P=0.000 5）的P值均＜0.005，所以3组交叉项对St存活率影响显著；从F值可以看出，3个因素对St存活率的影响为A（保护剂pH）＞C（混合比例）＞B（均衡时间）。模型的R2Adj=0.996 4，说明该模型能很好的描述99.64%的响应值结果，能够有效地反映各因素对响应值的影响。3个因素的交叉作用对响应值的影响如图5所示。根据软件的数据分析可得：保护剂pH值为6.57，平衡时间为29.71min，混合比例为2.05时，对St存活率来说是最佳试验条件。

2.4.3 各因素对Lb存活率的响应面优化试验和分析

Lb存活率不但取决于众多单因素的影响，也会受这些因素的交叉作用的影响。本试验对保护剂pH值、保护剂和菌泥平衡时间、保护剂和菌泥混合比例3个因素，及3个因素的交叉作用对Lb存货率的影响进行研究，结果如表6所示。

表6 响应面试验结果方差分析Table6 Analysisof variance for the fittedmathem aticalmodel

续表6 响应面试验结果方差分析Continue table6 Analysisof variance for the fittedmathem atical m odel

根据表6可以看出，模型的P值＜0.000 1，这说明该模型极显著，即该试验方案具有可靠性。失拟项P= 0.839 6＞0.05，说明没有失拟因素存在，回归方程具有较好的拟合性，该模型能模拟A、B、C 3个因素对Lb菌种存活率的影响。A、B、C的P值均＜0.000 1，所以A、B、C对存活率的影响是极显著的；AB（P=0.033 3）、AC（P=0.001 4）、BC（P=0.024 6）的P值均＜0.005，所以3组交叉项对Lb存活率影响显著；从F值可以看出，3个因素对Lb存活率的影响为C（混合比例）＞A（保护剂pH）＞B（均衡时间）；模型的R2Adj=0.997 1，说明该模型能很好的描述99.71%的响应值结果，能够有效地反映各因素对响应值的影响。3个因素的交叉作用对响应值的影响如图6所示。根据软件的数据分析可得：保护剂pH为6.57，平衡时间为29.97min，混合比例为2.01∶1（mL/g）时，对Lb存活率来说是最佳试验条件。

综合考虑，两种菌的存活率和实际操作等因素，将冻干菌悬液的制备条件修正为：保护剂的pH为6.57，平衡时间为30min，混合比例为2∶1（mL/g）。在此条件下，St和Lb的存活率分别为63.98%、66.21%，两种菌的存活率均达到最大值。综上所述，冻干菌悬液的最佳制备条件确定为：保护剂的pH为6.57，平衡时间为30min，混合比例为2∶1（mL/g）。

3 结论

本试验在单因素试验的基础上，进行响应面优化法试验得出最佳工艺条件为：St与Lb按活菌数1∶1混合（体积比），离心速度3 000 r/min，离心时间10min，预冻温度-80℃，预冻时间1 h，保护剂pH6.6，平衡时间30min，保护剂和菌泥混合比例为2∶1（mL/g）。在此条件下，可以同时确保St、Lb的高存活率，从而确保最终得到的冻干菌粉具有良好的发酵性能。本试验仅对冻干菌悬液的制备条件进行了响应面优化，对混合发酵液的制备条件只进行了单因素试验。混合发酵液制备过程中各因素间的交叉影响也会对St、Lb的存活率产生一定影响，所以在进一步的研究中应对混合发酵液的制备条件也进行响应面法优化，以降低各因素交叉作用对试验结果的影响。

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Optim ization on Direct Vat SetWith Response Surface M ethod

HANRong-wei1，YU Zhong-na2，LIU Lu1，WANG Jun1，*
（1.Collegeof Food Scienceand Engineering，Qingdao AgriculturalUniversity，Qingdao266109，Shandong，China；2.CollegeofHaidu，Qingdao AgriculturalUniversity，Laiyang265200，Shandong，China）

Directvatset（DVS）hasbecome themain developmentdirection ofyogurt fermentation agentdue to itshigh activity，good stability and easy to use.With the survival rate as the index，the single factor testofmixing ratio，centrifugalcondition and pre-freezing conditionwere conducted after the activation and purification of Streptococcus thermophilus and Lactobacillus bulgaricus.The results showed that the optimizing fermentation conditionswere：St∶Lb=1∶1（volume ratio），the centrifugal speed of 3 000 r/min，centrifugation time of 10min，pre-freezing temperature of-80℃，pre-freezing time of1h；The pH of protective agent，the protective agent，the bacterialmud balance time，the protective agentand themixed proportion of the bacterialmire were optimized by response surfacemethod and the resultsshowed that the optimizing conditionsof freeze dried suspension were：protective agent pH of 6.6，equilibration time of 30min，themixing ratio of protective agent and bacterialmireof2∶1（mL/g）.Under theoptimized conditions，survival ratesof St&Lbwere63.77%and 66.03%，respectively，which indicated agoodmarket foreground and application value.

Streptococcus thermophilus；Lactobacillusbulgaricus；directvatset；responsesurfacemethod

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.07.016

2016-12-05

农业部公益性农业行业科研专项（201403071-5）；山东省自然基金青年基金（2015ZRB01095）；山东省重点研发计划（2016GSF120010）；山东省优秀中青年科学家科研奖励基金（BS2014NY011）；青岛农业大学高层次人才科研基金（6631115043）

韩荣伟（1981—），男（汉），副教授，博士，主要从事乳品科学方面研究。

*通信作者：王军（1980—），男，副教授，博士，主要从事食品质量安全控制的研究。