靳廷丽，刘丽萍，易志强，张娜，唐翼龙，丁晨，廖清华

(1、江西省疾病预防控制中心，江西南昌330029；2、深圳市疾病预防控制中心，广东深圳518055)

江西人群CCL3L1基因拷贝数与HIV感染相关性研究

靳廷丽1，刘丽萍1，易志强1，张娜1，唐翼龙1，丁晨1，廖清华2

(1、江西省疾病预防控制中心，江西南昌330029；2、深圳市疾病预防控制中心，广东深圳518055)

目的研究江西省HIV/AIDS（艾滋病感染者/艾滋病病人）人群趋化性细胞因子配体蛋白CCL3L1（CC chemokine ligand 3－like－1）的拷贝数及其与HIV病毒（艾滋病病毒）易感性及艾滋病进展的关系。方法收集192例HIV/AIDS和131例阳性者配偶阴性血样标本，提取基因组DNA，应用PRT（the Paralogue Ratio Test）法检测其CCL3L1基因拷贝数，计算江西省人群CCL3L1基因拷贝数中位数，用SPPS统计软件分析CCL3L1拷贝数与HIV感染的关系。结果江西人群CCL3L1基因拷贝数中位数为2；HIV慢性感染者与健康人无显著性差异（P＞0．05）；第一次CD4淋巴细胞数与基因拷贝数的变化有显著相关(P＜0．05)。结论江西人群的CCL3L1基因拷贝数与HIV易感性无相关性，与感染进程有一定相关性。

江西；CCL3L1基因；艾滋病病毒；感染；相关性

CCL3L1蛋白是由CCL3L1基因编码，它是一种强效化学趋化细胞因子，可以调节免疫、参与免疫细胞分化发育并介导炎症反应，也是CCR5（HIV感染时主要辅助受体）的天然配体之一，据报道CCL3L1基因拷贝数量与HIV易感性和疾病进程有着重要的关系[1，2]，CCL3L1基因拷贝数在不同个体之间、不同地域的人种之间是有差异的，在同一区域的同一人种的CCL3L1基因拷贝数均围绕其平均值呈分散分布。例如，HIV阴性的非裔美洲人CCL3L1基因拷贝数平均为4个，而欧裔美洲人该值为2个[3，4]，对中国汉族人群的报道数值有1～4不等[5－7]，本研究针对江西省人群的CCL3L1基因拷贝数与HIV病毒感染相关性进行研究。

1 材料与方法

1．1研究对象收集2011年及之前确诊的HIV/ AIDS患者血样192份，男性110例，女性82例，平均年龄40岁，均已抗病毒治疗并排除合并肺结核感染。同时收集131份健康人群血样，该人群为阳性者配偶，男性39例，女性92例，平均年龄为42岁。

1．2实验方法

1．2．1基因组DNA提取按照QIAGEN试剂盒说明书提取DNA，提取的DNA浓度的测定利用NanoDrop－5000微量分光光度计，根据实际测量浓度值稀释或浓缩至5ng/μl。CCL3L1基因扩增的引物选择参考Gonzalez E等[3]CCL3AF－FAM：TCATA GTGGGTTCTCTGTTTC，CCL3AR：ATCCAGGGCTGCTTACTT，扩增条件37℃2min，95℃3min，预变性，94℃15s变性，60℃20s延伸，72℃20s，35个循环72℃10min 25℃1min反应结束后，制备琼脂糖凝胶进行PCR产物鉴定，CCL3L1基因长度为220bp，内参CCL3为226bp。

1．2．2 PCR产物的处理及毛细管电泳分析将鉴定完成的PCR产物稀释20倍，再分别将1μl稀释后的PCR产物、1μl LIZ500分子量内标和8μl Hi－Di Formamide置于0．2ml单管中涡旋振荡10s，2000 r/min分离心15s。将处理好的产物转移到96孔自动进样托盘上进行毛细管电泳（原理如图1）。见图2。

图1 来源Walker e tal./Genomics 93(2009)98-103

图2 CCL3A基因毛细电泳图谱

1．3数据分析根据样本DNA与内对照DNA扩增产物长度及荧光标记信息，利用GeneMarker V2．2．0对ABI3130测序仪生成的数据文件进行分析，输出每个产物峰的峰面积值，输出数据采用Excel进行处理分析。利用参照基因峰面积值（I）对目标基因峰面积值（S）进行校准后获取目标基因的准确拷贝数。计算：CCL3L1基因拷贝数=目标基因拷贝数/参考基因拷贝数×2。计算出各样本的CCL3L1基因拷贝数，用统计软件分别计算HIV阳性者和阳性者配偶的基因拷贝数的中位数；从艾滋病综合防治信息系统中查找出随访后第一次CD4淋巴细胞数和最近一次CD4淋巴细胞数，并计算CD4淋巴细胞数平均每月下降个数；采用SPSS21统计软件分析数据，根据概率P＜0．05，判断差异有统计学意义。

2 结果

2．1 HIV阳性者和阳性者配偶的基因拷贝数的中位数均为2。

表1 HIV阳性者和阳性者配偶的基因拷贝数情况

2．2 CCL3L1基因拷贝数与HIV易感性分析结果192名HIV/AIDS患者和131名健康的阳性配偶的CCL3L1基因拷贝数用中位数进行统计描述，用卡方检验CCL3L1基因拷贝数变异与HIV易感性的相关关系，差异无统计学意义。

表2 CCL3L1基因拷贝数与HIV易感性进行卡方检验分两种情况

2．3 CCL3L1基因拷贝数与CD4淋巴细胞数每月CD4淋巴平均变化数与CCL3L1基因拷贝数做相关统计。分别将前后两次的CD4淋巴细胞数均分为三组，分别为大于350个/μl，200～350个/μl和小于200个/μl，与CCL3L1拷贝数中位数进行统计描述，用Spearman相关分析CCL3L1基因拷贝数变异与CD4淋巴细胞数变化关系。结果是与第一次CD4淋巴细胞数有显著相关性，与最近一次CD4细胞数结果及CD4细胞平均月下降数均无相关性。

表3 与第一次CD4淋巴细胞数的关系

表4 与第二次CD4淋巴细胞数的关系

表5 与平均每月CD4淋巴细胞数变化的关系

3 讨论

CCL3L1基因位于17q的一个重复区域，该区域包括CCL3L1和CCL4基因，它们在不同个体间存在拷贝数的差异。其编码的CCL3L1蛋白是CCR5的高亲和性配体，可最有效地抑制HIV-1与CCR5结合进入细胞。早在2002年就有人提出CCL3L1基因拷贝数的变异可能会影响某些疾病的易感性和进程，但CCL3L1基因拷贝数与HIV-1感染的关系尚无定论。2004年Bugeja MJ等[8]首先对CCL3L1基因与HIV易感性、感染进程的影响进行了人群研究。发现CCL3L1基因拷贝数与HIV易感性、感染进程无关。

2005年Gonzalez E等[3]对不同地区和不同种族人群的CCL3L1基因拷贝数的分布进行了全面研究，以相应阴性人群的CCL3L1基因拷贝数的中位数为分界值，分析拷贝数与HIV感染易感性反应关系，发现其中高于中位数者，随拷贝数的增加获得HIV感染的危险性降低，而低于中位数者，随拷贝数减少获得HIV感染的危险性增高。这些结果显示，CCL3L1基因的相对拷贝数与HIV易感性之间存在剂量反应关系，个体对HIV易感性的差异决定于其CCL3L1基因拷贝数在相应种族人群的相对水平，即相对拷贝数，此外，CCL3L1拷贝数低于人群拷贝数中位数者的HIV感染者发展为艾滋病或死亡病程更短，提示CCL3L1基因相对拷贝数可影响艾滋病的发展进程。

本研究针对江西人群CCL3L1基因拷贝数对HIV影响的关系，采用的方法是Armour JA等[9，10]建立的一种精确测量基因拷贝数的新方法-the Paralogue Ratio Test(PRT)，采用一对引物扩增出两种产物，一种是目的基因产物，另外一种是参考基因产物，基因拷贝数通过他们的比值获得，这种方法已经成功用于DEFB4基因拷贝数与牛皮癣的关系研究中[11，12]，并与Gonzalez E等[3]的检测方法原理一致。本研究中阴性人群和阳性人群的CCL3L1基因拷贝数中位数均为2，采用人群的CCL3L1基因相对拷贝数中位数2为分界点进行统计分析，研究的结果得出HIV易感性与基因相对拷贝数无相关性。由于CD4淋巴细胞是艾滋病病毒侵犯的主要免疫细胞，本研究通过参照我省艾滋病感染人群的CD4淋巴细胞数的相关研究[13-15]来分析CCL3L1基因拷贝数对艾滋病进程影响，由于艾滋病常合并结核感染，为排除结核病对CD4淋巴细胞数的影响，我们收集血样时已经排除了合并结核病的样本。研究结果显示相对拷贝数与第一次CD4淋巴细胞数呈正相关性，而与第二次CD4淋巴细胞数及平均月CD4淋巴细胞数变化均无相关性，考虑原因可能为第一次CD4淋巴细胞数检测时均未开展抗病毒治疗，而第二次是经过了抗病毒治疗，而且治疗时间长短不一，治疗效果不一致，导致可比性降低，相比第一次CD4更有参考意义，由此提示CCL3L1基因相对拷贝数影响艾滋病进程。由于本研究样本量较小，阳性者配偶者相对一般人群接触艾滋病病毒的几率更高，作为实验阴性对照更有意义，但是不能排除部分阳性者配偶一直使用避孕套或者没有性生活，因此和艾滋病病毒接触机会就少，降低了阴性对照的可比性。我们得出的CCL3L1基因相对拷贝数与HIV易感性无相关性需进一步数据支持，进一步的研究需加大样本量，并选定更具有参照意义的人群，收集更多的病程进展的指标如病毒载量作为参数等。本研究的成果为我们进一步研究奠定了重要基础。

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Study of chemokine CCL3L1 gene copy number of people in Jiangxi province and its relationship with HIV-1 infection

JIN Tingli，LIAO Qinghua，LIU Liping，YI Zhiqiang ZHANG Na，TANG Yilong，DING Chen.Jiangxi Provincial Center for Disease Prevention and Control，Nanchang 330029，China.

Objective To study the chemokine CCL3L1 gene copy number of people in Jiangxi province and its relationship with HIV－1 infection．Methods Blood samples collected from the 192 cases of HIV/AIDS and 131 cases of HIV positive spouse who are HIV negative were used for the extraction of genomic DNA．The method of PRT(the Paralogue Ratio Test)was used to detect gene copy number of its CCL3L1，with that we calculated the median of CCL3L1 copy number in Jiangxi province．We investigated the relationship of CCL3L1 gene copy number with HIV by SPPS statistical software．Results The median of CCL3L1 copy number in Jiangxi province is two，and there is no statistical significant differences(P＞0．05)between the CCL3L1 copy number of HIV infected patients and that of healthy people．The first CD4 lymphocytes count after diagnosed is significantly correlated (P＜0．05)with CCL3L1 gene copy number．Conclusion The CCL3L1 gene copy numbers of people might not associate with the susceptibility to HIV but correlate with the progress of HIV/AIDS in Jiangxi．

Jiangxi；CCL3L1 HIV；Infection；Correlation

R512．91，R446．62

A

1674－1129(2017)02－0163－04

10．3969/j.issn.1674－1129．2017．02．008

2016-11-22；

2017-03-15)

江西省科技厅社会发展领域(20132BBG70098)

靳廷丽，1978年生，女，硕士，主管技师，主要从事艾滋病检测与防制工作。Email:150225439@qq.com

廖清华，1972年生，主要从事艾滋病检测与防制工作，Email：190898720@qq.com