褚焕宁，侯非凡，贾焱，李芳芳，李晓琳，李森，亢秀萍，邢国明

（山西农业大学园艺学院，山西太谷030801）

黄花菜无菌播种试验

褚焕宁，侯非凡，贾焱，李芳芳，李晓琳，李森，亢秀萍，邢国明

（山西农业大学园艺学院，山西太谷030801）

黄花菜（Hemerocallis citrina Baroni）兼具食用、观赏和药用价值，为了提升杂交育种后代的繁殖速度，试验以黄花菜种子为材料，经过不同的预处理和消毒处理后接种于MS培养基上进行无菌萌发，培养7 d后统计种子的污染率和发芽率；分不同生理苗龄建立适宜的炼苗体系。结果表明，浸泡24 h后剥去黑色革质外种皮和茸毛状内种皮，露出白色胚乳的预处理方式种子的污染率最低，为6%，萌发率最高，为80%；70%酒精30 s＋0.1%升汞消毒处理5，10 min，种子的污染率均较低，分别为8%和6%，消毒10 min种子的萌发率低于5 min；植株自然高度在6 cm以上的，移栽20 d后统计的成活率为100%。试验可为萱草属植物杂交后代的快速繁殖提供理论基础。

黄花菜；种子；无菌播种；幼苗；炼苗

黄花菜（Hemerocallis citrina Baroni）为百合科萱草属宿根草本植物[1]，又叫金针菜、忘忧草，是我国的一种特产蔬菜[2]。全属约14种，原产于中国、日本、朝鲜等地，其中，原产于我国的有11种，在我国有着悠久的栽培历史[3-4]。黄花菜资源非常丰富，应用广泛，观为花，食为菜，用为药。因其花型美丽可爱，群体花期长，叶丛优美，既可观花又可观叶，又因其对环境条件要求不严格，管理粗放，因此，可种植于疏林草地作地被观赏，种植于庭院、公园作花坛、花境等进行观赏，还可植于道路两旁及隔离带，具有很高的绿化和观赏价值[5-9]。黄花菜又是我国特产蔬菜，既可鲜食又可制成干菜食用，美味可口[10]。另外，黄花菜中含有丰富的蛋白质、维生素、糖和钙、磷等矿物质，具有抗衰老、消炎解毒，健脑、安神、明目等功效[11]。

黄花菜的繁殖方式多为分株繁殖。分株繁殖在较短时间内可获得具有开花能力的植株，并能保持品种特性，但繁殖系数低，易携带病虫草害，种苗成本高等[12]，难以满足种苗规模化生产的需求。种子繁殖得到的实生苗根系发达，适应环境能力强，但繁殖生产周期长，一般适用于杂交育种[13]。在杂交育种中，由于存在杂交不亲和现象，获得较少的杂交种子时，为提高种子的发芽率，同时加快种子成苗，会借助无菌播种，即将种子消毒处理后接种在培养基上萌发，成苗后炼苗移栽，在短时间内可获得大量实生苗[14-15]。这是培育黄花菜新品种采用的主要措施。

在前期试验黄花菜种子穴盘播种育苗的过程中发现，黄花菜种子播种后萌发时间长、萌发率低。本试验采用无菌播种的方法，研究不同预处理方式和消毒方式对种子萌发时间、发芽率和污染率的影响，以期缩短黄花菜种子的发芽时间，提高种子的发芽率，建立种子的无菌播种体系，从而提高杂交后代的繁殖速度，缩短育种周期[15]，为萱草属植物杂交后代的快速繁殖提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料

供试材料为山西农业大学黄花菜种质资源圃收集的地方品种茄子花1号（2n＝22）。于2015年9—10月收集种子，并在阴凉通风处晾干。

1.2 方法

选取大小一致饱满的种子，接种前对种子进行洗涤、蒸馏水浸泡、0.1%高锰酸钾浸泡、剥皮、热水浸种预处理；预处理后在超净工作台对种子进行表面消毒、浸泡消毒；将已消毒的种子接种到MS培养基上，每个培养瓶接种2粒，每个处理接种25瓶。将接种好的培养瓶置于25℃、相对湿度60%～70%的组织培养室中进行暗培养。种子萌发后进行光培养，光照强度为2 500 lx，每天光照16 h。

无菌播种7 d后统计种子的污染数和萌发数，并记录进行分析。

1.2.1 传统催芽播种对黄花菜种子萌发的影响将种子放在培养皿中，上下覆盖浸湿蒸馏水的纱布，在25℃、相对湿度60%～70%的恒温培养箱中进行催芽，定期更换蒸馏水，清洗发霉种子，观察种子萌发情况，将露白种子拿到温室进行播种，播种基质V草炭∶V珍珠岩＝2∶1。每天观察记录种子的萌发情况。

1.2.2 不同预处理方式对黄花菜种子萌发的影响

分别设置不同方式的预处理：A1.洗洁精洗涤，流动自来水冲洗干净，蒸馏水浸泡种子24 h；A2.洗洁精洗涤，0.1%高锰酸钾浸泡30 min，蒸馏水浸泡24 h；A3.蒸馏水浸泡24 h后剥去黑色革质外种皮，露出里面茸毛状内种皮，50℃热水处理后搅拌冷却；A4.蒸馏水浸泡24 h后剥去黑色革质外种皮和茸毛状内种皮，露出白色胚乳，冲洗干净。

预处理后在超净工作台上进行消毒处理，70%酒精30 s＋0.1%HgCl25 min，接种到蔗糖浓度为3%的MS培养基上。

1.2.3 不同消毒方式对黄花菜种子萌发的影响将茄子花1号种子用蒸馏水浸泡24 h后剥去黑色革质外种皮和茸毛状内种皮，露出白色胚乳，冲洗干净，在超净工作台上进行不同方式的消毒处理：B.70%酒精消毒30 s，2，5 min，分别编码为B1，B2，B3；C.70%酒精30 s＋6%NaClO消毒3，10，15 min，分别编码为C1，C2，C3；D.70%酒精30 s＋0.1% HgCl2消毒3，5，10 min，分别编码为D1，D2，D3。

消毒处理后接种到蔗糖浓度为3%的MS培养基上。

1.2.4 炼苗移栽无菌播种种子萌发后统一炼苗：种子刚露白（E1）；植株自然高度1～3 cm（E2）；植株自然高度4～6 cm（E3）；植株自然高度6 cm以上（E4），将4个生长阶段的幼苗种植到温室进行炼苗处理，基质V草炭∶V珍珠岩＝2∶1，前7 d在阴凉处炼苗，而后逐渐见光。

每7d观察统计苗子的成活率和生长状况。长势程度分为：良好（叶色深绿，叶片挺拔，长势旺盛）、一般（叶色浅绿，叶片卷曲，长势较弱）、较差（叶片发黄，叶片萎蔫，长势很弱）。

茄子花1号种子无菌发芽及炼苗过程如图1所示。

1.3 数据统计与分析

试验数据采用SPSS20.0进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 传统催芽播种对黄花菜种子萌发的影响

茄子花1号种子催芽过程中发现，催芽第5天种子开始露白，第5～12天大部分种子露白，历时8 d，7个种子发霉腐烂，11个种子到第40天仍无出芽迹象。种子催芽萌发率为64%，播种成苗率为81.25%（表1）。

表1 传统催芽播种对黄花菜种子萌发的影响

2.2 不同预处理方式对黄花菜种子萌发的影响

本试验对茄子花1号种子进行了4种不同预处理，结果发现，仅用蒸馏水或高锰酸钾浸泡，种子污染严重，发芽率很低，无法进行种子的繁殖，对种子进行剥皮处理后，污染率极显著降低，同时剥去内外种皮，萌发率极显著升高。由表2可知，不对种子进行剥皮预处理，污染率高达90%～96%，萌发率仅为4%～8%；而剥掉外面黑色革质外种皮，污染率极显著降到10%，萌发率为8%；同时剥掉黑色革质外种皮和茸毛状内种皮，污染率降为6%，显著低于只剥掉黑色革质外种皮，发芽率为80%，极显著高于其他处理。因此，无菌萌发过程中剥去种子内外种皮，可极显著降低污染率，同时极显著提高种子的萌发率。

表2 不同预处理方式对黄花菜种子无菌萌发的影响

2.3 不同消毒方式对黄花菜种子萌发的影响

本试验选用了3种组织培养中常用的消毒剂：70%酒精，5%NaClO，0.1%HgCl2。试验发现，污染率随着消毒剂强度的增大而降低，萌发率却有随消毒剂强度增大而降低的趋势。由表3可知，仅用酒精消毒，污染率高达90%以上，萌发率为70%～90%；70%酒精结合5%NaClO消毒，污染率为30%～34%，萌发率为76%～90%，效果略好；70%酒精结合0.1%升汞消毒，效果最好，污染率极显著降低，仅为6%～12%，萌发率为62%～82%。综合污染率和萌发率考虑，仅用酒精和酒精结合NaClO消毒处理的萌发率虽较高，但是污染率也很高，不适合对种子进行消毒；酒精结合升汞对种子灭菌10 min，污染率降到了最低，但萌发率也随之降低，也不适合进行无菌萌发种子的消毒；酒精结合升汞消毒3，5 min，污染率分别为6%和4%，萌发率分别为82%和78%，较适宜进行种子的消毒处理。

表3 不同消毒方式对黄花菜种子无菌萌发的影响

2.4 炼苗移栽

由表4可知，4个不同生长阶段的炼苗成活率差异达极显著水平。其中，刚露白种子（E1）移栽到穴盘里，成苗率最低；植株自然高度为1～3 cm（E2），20 d后成活率为12.5%，长势较差；植株自然高度为3～6 cm（E3），20 d后成活率为75%，长势一般；植株自然高度在6 cm以上（E4），20 d后成活率为100%，长势良好。

表4 炼苗情况

3 结论与讨论

茄子花1号种子传统恒温培养箱催芽播种过程中，种子集中露白时间为第5～12天，历时8 d，种子的发芽率为64%，成苗率为81.25%；无菌播种过程中，种子露白时间集中在前7 d，种子发芽率可达到82%且发芽后在培养基生长较快，待植株自然高度达到6 cm以上炼苗移栽，成苗率为100%。因此，无菌播种缩短了发芽和生根长叶时间，经后期炼苗移栽成活率高达100%，有利于萱草属植物种子的快速繁殖。

在种子萌发试验中，仅对种子进行简单的蒸馏水浸泡预处理，结果发现，种子的污染率高达90%以上且发芽率很低，在排除种子质量、环境等问题造成的污染率较高、萌发率较低的基础上，对种子进行热水浸泡、高锰酸钾浸泡、剥皮等处理，结果发现，污染率降低，发芽率提高。对于种子无菌发芽，预处理除菌方式很多。张文莲等[16]通过萱草种子无菌培养研究其快繁技术的试验中，采用0.3%高锰酸钾溶液对萱草种子浸泡30 min进行消毒，本试验借鉴此消毒方法；徐永清等[17]采用70℃干热处理，48 h冷却后冲洗的方法对月见草种子进行除菌，结果表明，种子经干热处理后污染率由原来的85%降低到12.5%，因此，干热处理可以起到除菌作用。

本试验采用蒸馏水浸泡24 h后剥去黑色革质外种皮和茸毛状内种皮，露出白色胚乳的种子接种到培养基上，污染率最低，为6%，萌发率最高，为80%；剥去种皮种子的萌发率显著高于未剥去种皮种子的萌发率，且剥去种皮后种子萌发较快而且整齐，这与周晓杰等[18]在百合远缘杂交种子快繁方法中的研究结果一致。张日清等[19]对榉树种子进行剥壳预处理后，种子萌动时间由60 d缩短到10 d。

对于萱草种子形状不规则，外种皮革质，致密光滑，内种皮茸毛状，不剥皮消毒污染率极高，剥去外种皮和内种皮，再进行消毒处理能显著降低污染率，可能是由种子内部有真菌感染所导致的。70%酒精＋0.1%升汞消毒处理，污染率最低，为6%～12%，但随着消毒时间的延长，种子的萌发率随之降低，可能是HgCl2有很强的毒性，经过HgCl2消毒处理后，HgCl2直接与种子的胚乳接触而将种子杀死，导致其最终发芽率降低[20]。

常用的外植体消毒剂有70%～75%酒精，2%～10%NaClO，0.1%～1%的HgCl2[21]。本试验使用单一消毒剂和2种消毒剂结合使用，其中，70%酒精30 s＋0.1%HgCl2结合使用的消毒效果最佳，其中，70%酒精30 s＋0.1%HgCl210 min，污染率降低到了6%。还可以对污染的种子进行二次消毒，以再次降低污染率。赵玉芬等[15]研究了大花萱草杂交种子试管内萌发情况，结果发现，对污染的种子重新消毒可降低污染率。

组培苗的炼苗移栽，尽管植株自然生长高度在3 cm以上的成活率达到75%～100%，移栽后植株叶片生长较快，但叶片发黄卷曲，植株整体纤细瘦弱，长势较弱。种子得到的苗子基本无须根，根量很少且根较长，导致炼苗时整体长势较弱。本试验对此研究不够深入，今后可在培养基中添加激素诱发更多根系，同时选择可诱发根系的栽培基质进行栽培，以得到粗壮、长势较强的植株。

［1］吴铁明，于晓英，冯爽英，等.野生重瓣大花萱草的选育Ⅱ.组织培养快速繁殖[J].湖南农业大学学报（自然科学版），2002（4）：305-307.

［2］苏承刚，张兴国，张盛林.黄花菜根状茎组织培养研究[J].西南农业大学学报，1999，21（5）：427-429.

［3］汪发赞，唐进.中国植物志第十四卷[M].北京：科学出版社，1980：52-62．

［4］熊治廷，陈心启，洪德元.中国萱草属数量分类研究[J].植物分类学报，1997，35（4）：311-316.

［5］王汉海，程贯召，杜延飞.大花萱草新品种“金娃娃”的组织培养和快速繁殖[J].植物生理学通讯，2002，38（5）：458.

［6］邵春艳.萱草新品种的引种栽培及抗旱性研究[D].北京：北京林业大学，2009.

［7］邱收.几个萱草属植物的耐盐性研究[D].长沙：湖南农业大学，2008.

［8］吴跃辉，庄志勇，吉赛群，等.美国大花萱草引种及生态适应性研究[J].湖南农业科学，2006（6）：29-31.

［9］孙徐骉，武荣花.萱草属植物研究进展[J].河南农业科学，2016，45（4）：7-11，18.

［10］杜秉健.黄花菜水醇提取物的抗抑郁和促睡眠活性及综合利用研究[D].北京：中国农业大学，2014.

［11］韩志平，张春业，马樱芳，等.黄花菜采后生理与贮藏保鲜技术研究进展[J].山西农业科学，2013，41（1）：103-106.

［12］铁曼曼，杨峰，谭华强，等.黄花组织培养研究进展[J].黑龙江农业科学，2015（9）：147-151.

［13］赵天荣，徐志豪，黄坚，等.大花萱草繁殖技术研究[J].宁波农业科技，2015（2）：14-17.

［14］郭志海，金立敏，周玉珍.不同品种大花萱草果实及种子特性比较[J].湖北农业科学，2012，51（17）：3768-3770.

［15］赵玉芬，储博彦，尹新彦，等.大花萱草杂交种子试管内萌发及快繁技术研究[J].种子，2013，32（1）：121-123.

［16］张文莲，安娜.萱草种子无菌培养及快繁技术研究[J].青海农林科技，2008（2）：17-19.

［17］徐永清，李海燕，王光海，等.月见草种子的无菌萌发条件[J].安徽农业科学，2010，38（33）：18832-18834.

［18］周晓杰，樊金萍，龚束芳，等.百合远缘杂交种子快繁方法的研究[J].作物杂志，2009，42（3）：110-113.

［19］张日清，刘海龙，汪灵丹，等.榉树无菌播种技术[J].经济林研究，2013，31（1）：139-142.

［20］梁毅，王永勤，关绚丽，等.不同消毒方法在洋葱组织培养中的应用[J].中国农学通报，2010，26（21）：223-226.

［21］巩振辉.园艺植物生物技术[M].北京：科学出版社，2008.

Study on the Aseptic Seeding ofHemerocallis citrinaBaroni

CHUHuanning，HOUFeifan，JIAYan，LI Fangfang，LI Xiaolin，LI Sen，KANGXiuping，XINGGuoming
（College ofHorticulture，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

Hemerocallis citrina Baroni have both edible,ornamental and medicinal values.To improve the speed of propagation of filial generation,the paper inoculated the Hemerocallis citrina Baroni seeds on MS culture medium after being pretreated and degermed with different methods,calculated the contamination rate and germination rate 7 days later and established the best suitable acclimatization system according to different physiological stages of seedlings.The results showed that the pretreatment of husking the black epidermis and the trichome internal epidermis to show the white endosperm after being soaked for 24 hours had the lowest contamination rate（6%）and the highest germination rate（80%）.The degerming effect of70%ethanol（30 s）＋0.1%HgCl2（5,10 min）on the surface of seeds had the lower contamination rate,which were 8%and 6%,respectively,but the germination rate of 0.1%HgCl210 min was lower than 5 min.The survival ratio was 100%of the plantlets with the plant natural height above 6 cm.This resech would provide basis for the rapid propagation ofthe Hemerocallis L.filial generation.

Hemerocallis citrina Baroni;seeds;aseptic seeding;seedling;acclimatization

S644.3

A

1002-2481（2017）04-0587-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.04.24

2017-01-11

山西省回国留学人员科研资助项目（2015-065）；高等学校博士学科点专项科研基金项目（20131403110005）

褚焕宁（1991-），女，河北石家庄人，在读硕士，研究方向：花卉栽培与生理。亢秀萍为通信作者。