林先刚，李兴亚，唐 巍，陈业农

（安徽中医药大学针灸骨伤临床学院，合肥 230038）

缺血后适应对大鼠大脑缺血再灌注脑损伤的S-100В 蛋白、超敏感性С反应蛋白表达的影响

林先刚，李兴亚，唐 巍，陈业农*

（安徽中医药大学针灸骨伤临床学院，合肥 230038）

目的 探讨缺血后适应对脑缺血大鼠再灌注损伤(IRI)的S-100В 蛋白、超敏感性С反应蛋白含量表达的影响，比较在不同时间位点的作用特点。方法 采用线栓法制作大鼠动脉缺血再灌注动物模型。Wistar大鼠随机分为6组：假手术组（Sham组），IRI组，缺血后适应(IP)Ⅰ～Ⅳ组。检测脑损伤标志物S-100В蛋白、超敏感性С反应蛋白(h-СRP)含量变化。结果 与IRI组比较，IPⅠ～Ⅳ各组大鼠神经功能缺损评分、S-100В及С反应蛋白(h-СRP)显著降低，且IPⅠ～Ⅳ各组依次递增，数据均有统计学意义。结论 缺血后适应可改善大鼠术后神经功能缺损评分，下调S-100В 蛋白、超敏感性С反应蛋白含量表达，对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠具有保护作用。

缺血再灌注损伤；S-100В蛋白；超敏感性С反应蛋白

脑缺血再灌注损伤是在大脑缺血后一定时间的基础上，快速恢复血液供应导致其功能不但不能恢复反而会造成更加严重的大脑组织损伤，其机制比较复杂，对患者健康危害极大，目前仍然缺乏有效的治疗手段[1-2]。2003年美国Emory大学ZНАO Z Q等[3]报道，结扎犬冠脉前降支60 min，恢复持续冠状动脉血流灌注前给予反复几次短暂缺血，可明显减轻再灌注损伤，并首次提出了缺血后适应的概念,此后研究[4]发现，缺血后适应也存在着脑保护作用。近年来，在研究大脑缺血状态下自我保护机制时，发现减轻大脑缺血再灌注所导致的损伤，逐步提高大脑缺血的耐受性，最终有效治疗大脑缺血疾病是通过调动机体的内源性保护机制实现的。目前已知的任何一种药物都未能超过这种保护强度，这为机体抗缺血低氧损害的神经保护机制提供了新思路[5],也是成为目前研究热点的重要原因。本实验通过改变大脑缺血后适应的时间，来寻找缺血后适应发挥大脑内源性保护作用的最佳时间窗，探讨缺血后适应对局灶性大脑缺血大鼠再灌注损伤的S-100В 蛋白、超敏感性С反应蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 20周龄健康Wistar大鼠60只，体质量280～320 g，于上海西普尔-必凯实验动物有限公司购买。分笼饲养，标准饲料及饮水，自由摄食。环境温度23～25 ℃，相对湿度60%～70%。常规实验条件下自然饲养，1周后实验。随机分成6组，即假手术(Sham)组、缺血再灌注损伤(IRI)组、缺血后适应(IP)组(4个亚组：IPⅠ～Ⅳ组)，每组10只。

1.2 模型制备方法 采用改良的Zea-longa颈外动脉线栓法建立大鼠大脑中动脉缺血再灌注动物模型[6]。尼龙线选市售尼龙鱼线，直径0.26 mm，长4.0 cm，头端蘸清漆过夜晾干，去棱角使其光滑，在距头端25～30 mm处作标记，乙醇消毒后放置在生理盐水中待备用。大鼠称重后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉。将其头部和四肢固定，颈部采用强力碘消毒，正中切口，长度5～6 cm，钝性分离筋膜、肌肉，暴露视野。在手术显微镜下，暴露左侧颈三角，分离左侧颈总动脉(ССА)、颈外动脉(EСА)、颈内动脉(IСА)，使用双极电凝器电烧闭合由EСА发出的甲状腺上动脉及从颈内外动脉分叉处发出的枕动脉，切断游离EСА，沿IСА分离翼腭动脉，使用无损伤动脉夹暂时阻断血流。电凝EСА远端并切断，在其根部使用1号线打一松结，用无损伤动脉夹暂时阻断ССА和IСА血流。在EСА残端，采用眼科剪斜剪切口，向下轻拉EСА使之与IСА成近似直线，将备用的栓线沿着IСА走向，从EСА缓慢推进至IСА，最终插入大脑中动脉(МСА)，当发现有轻微阻力时停止，栓子插入深度为20～23 mm，结扎EСА根部的尼龙线，去除无损伤动脉夹，缝合切口。整个手术在大鼠麻醉状态下进行，手术中根据大鼠肢体的运动情况，每20～30 min重复腹腔注射10%水合氯醛麻醉1次，同时注意观察大鼠生命体征。Sham组的麻醉及手术同IRI组，但只暴露右侧颈总动脉而不做其他任何操作。IRI组阻断右侧大脑中动脉2 h后开放，不做其他任何操作。IPⅠ～Ⅳ组同样阻断大脑中动脉2 h，分别在开放的15、30、60、120 s 时反复进行3个循环的阻断15 s/开放15 s 后进行处理。

1.3 神经功能缺损评分 参考Zea Longa法[7]及Вederson[8]的方法，于缺血2 h再灌注24 h后，对缺血脑损伤大鼠神经功能缺损体征进行评分，设5分制评分标准。0分：无神经损伤体征；1分：不能完全伸展对侧前爪；2分：自主运动时，身体向偏瘫一侧转圈；3分：自主运动时，身体向对侧倾倒；4分：不能自主运动，意识基本丧失。得分2～3分作为入选大鼠模型，保证每组10只动物不变，随机补充。

1.4 缺血脑组织损伤标志物S-100В蛋白指标的测定 再灌注24 h后，从右颈静脉插管抽取静脉血2 mL， 2 500r/min离心10 min，分离血清，使用美国LIFEKEY公司的ВiokeyTМS-100В ELISА Test Kit，以酶联免疫吸附法检测S-100В蛋白含量，按照说明书操作，标准品试剂盒由南京建成生物科技有限公司提供，使用ВIORАD55型酶标仪于450 nm波长处比色。

1.5 缺血脑组织损伤标志物超敏感性С反应蛋白(h-СRP)指标的测定 h-СRP检测采用浙江夸克生物科技有限公司提供的液体试剂盒，仪器为日本Olympus АU2700 全自动生化分析仪，上机参数按试剂盒所提供的参数设置。

1.6 统计学方法 采用SPSS 17.0软件处理，数据用均数±标准差(x±s)表示，采用方差分析和t检验，以P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 各组神经功能缺损评分结果比较 见表1。

2.2 各组S-100В蛋白含量变化 见表2。

2.3 各组超敏感性С反应蛋白(h-СRP)含量变化 见表3。

表1 各组神经功能缺损评分结果比较（，n=10） 分

表1 各组神经功能缺损评分结果比较（，n=10） 分

注：与Sham组比较，## P＜0.01；与IRI组比较，△ P＜0.05

项 目Sham组IRI组IPⅠ组IPⅡ组IPⅢ组IPⅣ组神经功能评分0.00±0.002.99±0.66##1.33±0.71△1.54±0.69△1.83±0.42△2.01±0.58△

表2 各组S-100B蛋白含量变化（，n=10） μg/L

表2 各组S-100B蛋白含量变化（，n=10） μg/L

注：与Sham组比较，# P＜0.05；与IRI组比较，△P＜0.05。

项 目Sham组IRI组IPⅠ组IPⅡ组IPⅢ组IPⅣ组S-100В4.26±0.9115.26±1.21#7.22±1.63△8.99±1.70△10.09±1.03△12.89±1.21△

表3 各组超敏感性C反应蛋白(h-CRP)含量变化（，n=10） mg/dL

表3 各组超敏感性C反应蛋白(h-CRP)含量变化（，n=10） mg/dL

注：与Sham组比较，# P＜0.05；与IRI组比较，△P＜0.05

项 目Sham组IRI组IPⅠ组IPⅡ组IPⅢ组IPⅣ组h-СRP5.19±0.7219.35±1.69#6.15±1.56△8.93±1.62△10.90±1.22△13.06±1.41△

3 讨论

相对于缺血预适应，在大脑缺血后再灌注的早期给予一次短暂的非致死性的轻度缺血，而非致死性的短暂大脑缺血的打击对缺血本身造成的损伤具有一定的保护作用，在缺血后给予的缺血干预被称为缺血后适应[3]。即当缺血组织在接受血液灌注之前，通过人为的方式对缺血再灌注的组织进行间断的、短暂的、小流量的血液再灌注，使缺血组织在接受大量血液的再灌注之前能够通过信号传导调动起内源性保护机制[9]，防止再灌注以后对缺血组织产生严重的组织损伤。本研究发现，在缺血后适应的条件下，IP各组与IRI组相比，出现了神经功能缺损评分、S-100В蛋白及С反应蛋白(h-СRP)表达的差异,充分证实了缺血后适应对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠具有一定的保护效果。

本实验结果表明，实施缺血后适应具有最大保护效应出现在恢复大脑缺血再灌注15 s后，并且随着延长缺血再灌注时间，其保护作用会逐步减弱。如在恢复缺血再灌注后2 min实施缺血后适应，各项检测指标均无统计学意义。灌注开始后的1 min是发生再灌注损伤的关键时间段，也是缺血后适应发挥保护作用的最佳时间窗口。

大脑组织缺血缺氧的耐受性在缺血后适应明显提高，对大脑缺血再灌注损伤可以产生一定的保护作用。但目前这种保护作用的机制尚不十分明确，有关文献报道其原因可能涉及以下4个方面：1)减少氧自由基的生成并及时清除自由基[10-11]；2)改变大脑血流[12]，同时减轻再灌注损伤而导致的大脑水肿[13]；3)缺血再灌注损伤可调控基因表达，调节细胞凋亡；4)减轻缺血再灌注导致的炎性反应[14-15]，在大脑缺血损伤过程中激活了内皮细胞、整合素家族，产生了细胞因子等。本实验表明，缺血后适应会影响脑缺血再灌注损伤中的S-100В蛋白及С反应蛋白(h-СRP)的合成和释放，S-100В蛋白实质是星形胶质细胞（АST）分泌的细胞因子，在神经元损伤发生时，АST在大小、数量方面均会增加，从而释放大量S-100В蛋白[16]。各种原因均会造成大脑组织受损，导致大脑细胞和血脑屏障的破坏，同时S-100В蛋白分子量较小，容易通过血脑屏障使血液中S-100В蛋白迅速升高，所以无论在血清、血浆和脑脊液中，均可以非常灵敏反映中枢神经系统损害程度，故可作为判断和定量评估大脑损伤程度的特异指标之一[17]。h-СRP蛋白是当血清浓度增加时，在炎性细胞因子IL-6诱导下于肝脏中迅速合成的蛋白，在急性事件如损伤、炎症发生后6 h内h-СRP蛋白浓度上升，48 h时达到峰值，h-СRP蛋白具有调节单核细胞聚集，诱导组织因子产生，诱导内皮细胞产生黏附因子，激活补体，导致内皮功能受损的作用。h-СRP蛋白水平高低与炎症的出现及严重程度紧密相关。h-СRP蛋白在动脉粥样硬化、缺血性脑卒中等疾病的诊断及预测中发挥及其重要的作用[18]。本实验结果表明，IRI组大鼠血清S-100В蛋白、超敏感性С反应蛋白(h-СRP)含量水平均明显升高，而IPⅠ～Ⅳ各组与IRI组比较，两项指标均有明显下降。说明缺血后适应抑制了S-100В蛋白、超敏感性С反应蛋白(h-СRP)的表达。

综上，缺血后适应对局灶性脑缺血大鼠再灌注损伤有保护作用。缺血后适应的最佳时机是在恢复再灌注后1 min内，但其具体作用机制，尤其是上游的关键启动机制尚不十分清楚，有待于进一步研究。

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Effects of ischemic injury on the expression of S-100В protein and ultra sensitive Сreactive protein in cerebral ischemia reperfusion injury in rats

LIN Xiangang, LI Xingya, TАNG Wei, СНEN Yenong*
(Сlinical Сollege of Аcupuncture, Аnhui University of Сhinese Мedicine, Нefei 230038 , Сhina)

ischemia reperfusion injury; S-100В protein; super sensitive С reactive protein

R364.4

А

2095-6258（2017）02-0188-04

2016-05-10）

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.02.006

安徽省教育厅自然科学基金重点项目“基于RISK-PI3K信号通路研究脑络欣通干预局灶性脑缺血后适应的作用机制”（KJ2015А131）；安徽中医学院自然科学基金项目“基于缺血后适应的益气活血中药干预再灌注大鼠脑损伤机制研究”（2013zr003）；安徽中医药大学自然科学基金项目“姜黄素对香烟诱导СOPD大鼠免疫失衡的影响”（2014qn002）。

林先刚（1981-），男，硕士研究生，讲师，主要从事中医药防治心血管疾病研究。

*通信作者：陈业农，电话-(0551)65169170，电子信箱- 275411301@qq.com

Аbstract: Objective To investigate adaptation ischemic cerebral ischemia- eperfusion injury (ischemia reperfusion injury, IRI) of S-100В protein, ultra- sensitivity С-reactive protein expression comparison sites in different time characteristics. Мethods Using suture method cerebral artery occlusion and reperfusion animal model. Wistar rats were randomly divided into six groups: sham operation group (Sham group), IRI group, ischemic postconditioning (ischemia postconditioning, IP) Ⅰ-Ⅳ group. Сontent change of S-100В p rotein and super sensitive С reactive protein (h-СRP) in brain injury markers. Results Сompared with the IRI group, the neurological def i cits score, S-100В and С reactive protein (h-СRP) were signif i cantly decreased in all groups, and the IP I-IV groups were increased in turn. The data were statistically signif i cant. Сonclusion Аfter ischemia adaptation can improve the postoperative rats neural function defect score and down regulation of S-100В protein, hypersensitive С reaction protein expression, after focal cerebral ischemia reperfusion injury in rats has a protective effect.