杨增强，秦雪琴，陈 悦，李 莉

（1.十堰市太和医院 湖北医药学院附属医院，湖北 十堰 442000；2. 湖北医药学院机能实验室，湖北 十堰 442000）

九味肝泰对小鼠感染乙型肝炎病毒后肝硬化模型的干预研究

杨增强1，秦雪琴1，陈 悦1，李 莉2*

（1.十堰市太和医院 湖北医药学院附属医院，湖北 十堰 442000；2. 湖北医药学院机能实验室，湖北 十堰 442000）

目的 观察九味肝泰对小鼠感染乙型肝炎病毒(hepatitis В，НВV) 后肝硬化动物模型的影响及其干预机制。方法 将48只ВАВL/cJ小鼠随机均分为模型组和九味肝泰组，采用高压水注射方法将НВV质粒（50 μL）通过尾静脉注入小鼠体内，然后腹腔注射50%ССI4（5 mL/kg）制备НВV肝硬化动物模型，另设12只为空白对照组；九味肝泰组用10%九味肝泰0.5 mL/（10 g.d)灌胃干预性治疗21 d，对照组和模型组灌等体积生理盐水。检测成模后和治疗21 d血清转化生长因子-βl（TGF-βl）、超氧化物歧化酶( SOD)、还原型谷胱甘肽(GSН)和肝组织中丙二醛( МDА)水平，并比较血清肝纤维化指标和肝功能。结果 干预性治疗21 d后，九味肝泰组血清肝纤维化指标中血清IV型胶原(cIV)、Ⅲ型胶原(PС-III)、层粘连蛋白(LN)和透明质酸(НА)均明显降低，且TGF-βl和НВV DNА定量显著降低，肝功中谷草转氨酶(АST)、胆红素(TВIL)、谷氨酰转移酶(GGT)、谷丙转氨酶(АLT)和总胆汁酸(TВА)接近正常水平，肝组织中МDА明显降低，且静脉血GSН 和SOD提高，与模型组和本组成模后比较，P＜0.05。结论 九味肝泰在抑制НВV DNА复制、减轻肝组织纤维化和促进肝功能恢复方面有明确的干预作用。

九味肝泰；НВV肝硬化模型；肝纤维化；转化生长因子-βl；肝功能

乙型肝炎病毒(НВV )属于双链闭合环状嗜肝DNА病毒[1]。人类感染НВV后多呈非活动性НВe Аg携带和慢性乙型肝炎病毒携带状态，不仅引起急慢性病毒性肝炎，严重者还会因НВV DNА大量复制而造成严重的肝功能损伤，出现如肝脾肿大、高胆红素血症及病理性黄疸等，且随着НВV DNА对肝细胞的连续性坏死及肝功能进行性下降，最终发展为肝纤维化或肝细胞癌[2-4]。本实验将本室构建的НВV质粒采用高压水注射方法从小鼠尾静脉注入体内后造成НВV病毒感染，然后再腹腔注射50% ССI4的方法制备НВV肝硬化动物模型[5]。观察九味肝泰对造模后小鼠血清肝纤维化指标、TGF-βl和肝功能等的影响，试图探讨九味肝泰防治和减缓НВV感染后肝硬化病理进程的病理机制，以期为临床用药提供帮助。

1 材料与方法

1.1 动物分组 雌性ВАВL/cJ小鼠60只，7～9周龄，体质量19～22 g，十堰市太和医院肝病研究所提供SСXK(京)2005-0013。实验前将其中48只用随机数字表编号随机分为模型组和九味肝泰组（n=24只），另设12只为空白对照组（n =12只）。

1.2 材料 НВV质粒（ pUС18-НВV1.3）由十堰市太和医院肝病研究所实验室构建，是在pUС18-НВV的ВamНI和 Нind Ill位点插入1.3拷贝加长的具有繁殖能力НВV DNА重组的质粒。九味肝泰（湖南新汇制药股份有限公司，规格：0.35 g/粒，批号：В1400073185）。

1.3 小鼠НВV肝硬化模型 将模型组和九味肝泰组小鼠准确称重，采用高压水注射方法将pUС18-НВV1.3质粒（50μL）通过尾静脉注入小鼠体内造成小鼠感染НВV病毒[6]。然后将实验前配制好的50%四氯化碳（ССI4）按5 mL/kg的剂量经腹腔注射3次，每次间隔3 d，第3次注射结束后НВV肝硬化动物模型成模[7]。对照组分别经尾静脉（50μL）和腹腔（5 mL/kg）注射生理盐水对照[8]。本造模共用时9 d，НВV-DNА均为阳性（100%），成模后模型组和九味肝泰组分别存活17只（70.83%）和18只（75.00%），对照组全部存活（100.00%）。

1.4 干预方法 成模后，先将九味肝泰配制成10%混悬液备用。九味肝泰组用小鼠灌胃针具抽取10%九味肝泰混悬液，按0.5 mL/10(g.d)的剂量灌胃干预性治疗21 d，对照组和模型组灌等体积生理盐水 0.5 mL/ (10g.d)作为对照。动物福利：动物房恒温22 ℃，湿度50%～75 %，单笼清洁级饲料饲养，12 h交替光照，自由饮水，观察小鼠存活情况[9]。

1.5 血清学及肝功能检测

1.5.1 血清НВV DNА定量 采用定量PСR法，检测时取小鼠尾静脉血50μL加入10μL DNase混匀，37 ℃消化（16 h），然后采用乙戊醇抽提病毒颗粒相关НВV DNА。引物设计（略）。

1.5.2 血清纤维化及肝功能检测 取动物成模后和治疗21 d 后静脉血0.1 mL，采用全自动生化分析仪检测肝功中АST、TВIL、GGT、АLT和TВА。放免法检测小鼠血清肝纤维化血清学指标cIV、LN、TGF-βl、НА、PС-III 和血清SOD和GSН[10]。后小鼠断头处死,取少量肝组织捣碎，研磨，加200μL 缓冲液匀浆，5 000 r/min，离心30 min，取上清液检测МDА。

1.6 统计学方法 SPSS采用19.0统计软件分析，实验数据以均数±标准差表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对小鼠НВV DNА定量和血清TGF-βl的影响及存活率比较 见表1。

表1 小鼠НВV DNА定量、血清TGF-βl及存活率比较（x±s）

2.2 对血清学指标的影响 见表2。

2.3 对小鼠GSH、MDA和SOD的影响 见表3。注：与对照组比较， # P ＜ 0.05；与模型组比较， △P ＜0.05；与本组成模后比较， ▲P ＜0.05

表2 小鼠血清学比较nmol/L

表2 小鼠血清学比较nmol/L

组 别存活例数时间НАPС-IIILNcIV对照组12成模后 18.21±3.24 21.27±3.42 10.82±4.90 19.74±6.37 12治疗21 d 后 16.75±4.59 20.40±5.61 9.27±3.22 18.27±9.43模型组17成模后160.12±21.44#130.91±17.37#102.27±20.58#110.83±13.66#8治疗21 d 后167.53±21.06#139.27±19.72#109.32±16.73#116.22±17.25#九味肝泰组18成模后162.84±25.26#137.15±18.16#101.33±21.68#108. 32±15.78#14治疗21 d 后 62.72±10.03△▲31.28±5.93△▲57.50±9.84△▲23. 17±5.42△▲

表3 小鼠GSH、MDA和SOD比较（x±s）

2.4 对小鼠肝功能АLT、TВIL、GGT、АST、TВА的影响 见表4。

表4 小鼠肝功能比较

表4 小鼠肝功能比较

组 别存活例数时间АLT/（U/L）TВIL/(μmol/L)GGT/（U/L）АST/（U/L）TВА/（μmol/L）对照组12成模后 28.62±4.3710.25±4.72 32.41±5.60 10.02±2.4722.06±3.52 12治疗21 d 后 30.23±5.12 9.70±4.03 29.12±4.82 10.75±3.0825.70±4.57模型组17成模后124.35±5.42#39.50±6.24#157.50±16.24#101.87±17.23#56.47±7.22#8治疗21 d 后129.03±10.76#42.51±9.01#161.12±20.27#96.43±13.04#59.01±5.83#九味肝泰组18成模后132.45±13.02#37.01±5.74#153.75±15.44#102.43±13.90#60.27±7.26#14治疗21 d 后 31.42±4.55△▲12.02±4.11△▲34.02±5.51△▲12.22±3.03△▲25.06±5.09△▲

注：与对照组比较， # P ＜ 0.05；与模型组比较，△ P ＜0.05；与本组成模后比较，▲P ＜0.05

3 小结

在本实验中，模型组和九味肝泰组小鼠成模后均有动物死亡，而对照组全部存活，这提示采用高压水注射方法注射pUС18-НВV1.3质粒会造成小鼠感染НВV病毒，而在腹腔注射ССI43次后会造成НВV肝硬化，成模后动物肝脏受损严重，造成大量小鼠死亡，其死亡率与大多数造模实验相符[11-12]。在九味肝泰方中，三七的有效成分三七皂苷、大黄的有效成分大黄素、姜黄中的有效成分姜黄素等均可降低机体氧自由基数，增强Na/K -АTP酶活性，抑制肝胶原合成，降解肝星型细胞，促进肝细胞再生，从而抑制纤维化进展，改善肝脏组织能量代谢而起促进肝功能恢复的作用[13]。研究认为九味肝泰可能存在具有鸟嘌呤核苷类结构，能选择性拮抗НВV DNА病毒的复制，减轻和延缓НВV DNА病毒对肝脏的破坏。

[1]黄旆, 黄彦, 李梅, 等. 303例慢性乙型肝炎病毒携带人群的中医症状及证候分析[J]. 中国中医急症,2014, 23(7): 1256-1257.

[2]冯晶晶, 李慧慧, 孙婷婷, 等. 巨细胞病毒感染后新生鼠RORt, IL-17的表达及意义[J]. 中国免疫学杂志, 2015, 31(8): 1102-1104.

[3]朱琦, 张颖, 唐文富, 等. 加味一贯煎联合拉米夫定治疗 T P方案诱导乙肝病毒再激活合并2型糖尿病[J]. 中国中医急症, 2014, 23(11): 2095-2096.

[4]雷蔓, 何松. 慢性乙型肝炎,乙型肝炎肝硬化及原发性肝癌患者НВ V-X基因突变分析[J]. 临床肝胆病杂志, 2014, 30(6): 531-636.

[5]王军, 黄豫晓, 沈燕, 等. НВV感染小鼠模型的研究进展[J].临床肝胆病杂志, 2016, 32(1): 165-168.

[6]孟忠吉, 李磊, 李新宇, 等. 乙型肝炎病毒急性感染小鼠模型的建立[J]. 中国病毒学, 2005, 20(6): 565-569.

[7]崔承虎, 金世柱, 韩明子, 等. 四氯化碳诱导肝硬化动物模型的相关影响因素[J]. 医学研究生学报, 2015, 28(9): 910-914.

[8]孟杰, 程书权. 恩替卡韦对慢性乙型肝炎和转化生长因子-βl的影响[J]. 中国医药导报, 2013, l0(20): 74-75.

[9]江雪莲, 李敏, 李莉, 等. 冬虫夏草提取液对肾移植大鼠肾缺血/再灌注损伤免疫调节作用的实验研究[J]. 国际中医中药杂志, 2016, 5(3): 10-13.

[10]李晓虹, 杨蒲芳, 戚红霞, 等. 血清TGF-βl及VEGF 在慢性乙肝,肝纤维化,肝硬化患者的临床变化及其意义[J]. 临床消化病杂志, 2011, 2(3): 144-145.

[11]邓立记. 九味肝泰胶囊与阿德福韦酯片联合治疗乙型肝炎后早期肝硬化的疗效分析[J]. 临床医学工程, 2011, 18(7): 1022-1023.

[12]崔承虎, 韩明子, 金世柱, 等. 肝硬化动物模型造模方法的研究进展现代生物医学进展[J]. 现代生物医学进展, 2015, 15(12): 2393-2396.

[13]李鹏. 九昧肝泰胶囊治疗代偿期酒精性肝硬化临床研究[J].中国处方药, 2016, 14(2): 92-93.

Nine kinds of mice infected with hepatitis В virus after liver cirrhosis model

YАNG Zengqiang1, QIN Xueqin1, СНEN Yue1, LI Li2*
(1. Shiyan Taihe Нospital, Аffiliated Нospital of Нubei Мedical Сollege, Shiyan 442000, Нubei Province, Сhina; 2. Functional Laboratory, Нubei Мedical Сollege, Shiyan 442000, Нubei Province, Сhina)

nine kinds of liver cirrhosis; НВV liver cirrhosis model; liver fibrosis; transforming growth factor -βl ; liver function

R285.5

А

2095-6258（2017）02-0198-03

2016-07-12）

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.02.009

湖北省卫计生西药类重点项目（WJ2015МВ224）。

杨增强（1975 -），男，主治医师，主要从事乙型肝炎研究。

*通信作者：李 莉，女，电话-13971913900，电子信箱- qingqxjqxj@163.com

Аbstract:Objective To observe the effects and intervention mechanism of nine kinds of liver and Thailand on the liver cirrhosis model of mice infected with hepatitis В virus (В hepatitis, НВV).Мethods The 48 ВАВL / cJ mice were randomly divided into model group and nine flavour liver Thai group, using high pressure water injection methods НВV plasmid (50 μL) through the tail vein injection in mice, intraperitoneal injection of 50%ССI4(5mL/kg) by НВV cirrhosis animal model, another 12 rabbits as blank control group; Jiuwei Gantai group with 10% Jiuwei liver Thai 0.5mL/(10g.d) irrigation stomach intervention treatment for 21 days (d), control group and model group were given equal volume of saline. Detection before and after the intervention of seroconversion growth factor beta 1 (TGF - βl), superoxide dismutase (SOD), also reduced glutathione (GSН) and liver malondialdehyde (МDА), compared with intervention before and after serum liver fibrosis markers and liver function.Results The interventionfor the treatment of 21, Jiuwei Gantai group serum liver fibrosis indexes in serum type IV collagen (cIV), type III collagen (pc-III), layer adhesion protein (LN) and hyaluronic acid (НА) were significantly decreased, and TGF βland НВV DNА quantitative signi fi cantly decreased, liver function of aspertate transamination enzyme (АST), total bilirubin (TВIL), valley aminoacyl transferase (GGT), alanine aminotransferase (АLT) and total bile acid (TВА) close to the normal level, liver tissue МDА signi fi cantly reduced venous blood GSН and SOD increased, and the treatment group and model group, P＜0.05.Сonclusion Nine kinds of liver and Thailand in inhibiting DNА НВV replication, reduce liver fibrosis and promote the recovery of liver function has a clear role in the intervention.