冀娇娇，袁 将，张亚丽，王加利，全庆华，姬瑞芳，刘永刚

（北京中医药大学中药学院，北京 100102）

秀丽隐杆线虫模型在中药活性筛选中的方法学考察

冀娇娇，袁 将，张亚丽，王加利，全庆华，姬瑞芳，刘永刚*

（北京中医药大学中药学院，北京 100102）

目的 基于秀丽 隐杆线虫生物模型，建立快速筛选中药活性的方法。方法 选用亨廷顿舞蹈症疾病模型АМ141线虫株作为模型，以骆驼蓬多糖和小檗碱为代表药物，分别在固体及液体培养基中加入中药提取物或 单体小分子 化合物，以中药提取物溶解度、培养基有无污染、线虫polyQ荧光点数目、线虫形态及生长状态作为考察指标。结果 小檗碱20 μМ和骆驼蓬多糖10 mg/mL可显著抑制АМ141线虫的polyQ聚集症状。液体培养基中的线虫易污染，长势不一，且中药提取物溶解性不好影响观察，所以筛选中药提取物时应使用固体培养基。结论 秀丽隐杆线虫模型用于药物筛选，快捷、方便、简单。

秀丽隐杆线虫；中药；活性筛选

秀丽隐杆线虫 (caenorhabditis elegans，简称“线虫”)是经典的模式动物，以结构简单、生命周期短、与人类基因保守性较高等独特优势，被广泛用于生命科学领域的研究[1-2]。此外，由于线虫在药物筛选方面独特

的优势，如无需药物诱导即可造模，能够稳定遗传等优势，使线虫逐渐成为新型的药物筛选平台[3-6]。人口老龄化趋势上升，神经退行性疾病成为影响人类生活的一大障碍[7]。中药在治疗神经退行性疾病方面具有很大的潜力[8]，但由于中药成分复杂等特点，使其在药效研究及机制探讨上困难重重。因此，笔者应用线虫亨廷顿舞蹈症疾病模型АМ141线虫株，建立适用于快速筛选治疗神经退行性疾病活性中药成分的方法学，为线虫作为活性药物筛选模型的建立提供数据支持。

1 材料

1.1 材料 骆驼蓬种子由新疆医科大学提供。肉苁蓉购自北京同仁堂；小檗碱购自中国食品药品检定研究院。所用有机试剂均为分析纯，购自北京化工厂。

1.2 仪器 生化恒温培养箱（天津泰斯特仪器有限公司）；体式显微镜（Nikon公司）；荧光显微镜（Zeiss公司）；激光共聚焦扫描显微镜（Zeiss公司）。

1.3 动物模型 秀丽隐杆线虫亨廷顿舞蹈症疾病模型АМ141线虫株（rmIs133 [unc-54p::Q40::YFP]）购自СGС线虫中心。

2 方法

2.1 中药组分提取 称取骆驼蓬种子20 g置于索氏提取器中，依次加入石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、蒸馏水提取并过滤，各提取部位的滤液蒸干后置于真空干燥箱中干燥过夜。于- 20 ℃保存。分别取粉末或液状提取物置于ep管中溶解，配制成10 mg/mL的药液。骆驼蓬多糖及肉苁蓉多糖的提取采用水提醇沉法[9]。

2.2 线虫培养 线虫培养于22 ℃恒温培养箱中，在涂有大肠杆菌OP50的培养基上生长发育。

2.3 加药食物的配制 线虫以大肠杆菌E.coli OP50为食。为保证线虫能够充分与药物接触，故在大肠杆菌中也加入相应浓度的药物。为避免大肠杆菌对中药成分的代谢，使其产生降解，故使用死菌。取新鲜的E.coli OP50菌液于65 ℃加热2 h，置于离心管中高速离心(14 000 r/min，10 min），去除上清液（- 20 ℃保存）。将药液加入离心管中，充分混匀，配制成为加药食物。

2.4 固体及液体培养基的加药方法 培养基的配方见参考文献[10]。取配制好的提取物，均匀涂抹于固体培养基表面，待其充分吸收后加入含药食物，同样均 匀涂抹。液体培养基需要取配制好的加药食物40 μL，与液体培养基充分混匀即可备用。

2.5 线虫的同步化 在载玻片上加入10 μL М9缓冲溶液，挑取一定数量的成虫置于М9中，用灭菌后的手术刀从线虫腹部切开，将卵释放在М9中，再用移液器将虫子转移至液体或固体培养基中。放入22 ℃恒温培养箱中培养3 d后，挑取一定数量的成虫置于荧光显微镜下观察表型。

2.6 观测指标 针对АМ141线虫株，当药物具有治疗亨廷顿舞蹈症药效时，会使多聚谷氨酰胺和黄色荧光蛋白聚集产生的黄色荧光点会减少或者弥散，所以荧光点的多少被作为药物有无效果的重要指标[11]。

3 结果

3.1 不同加药方式对线虫的影响

3.1.1 提取物溶解性 为了更加准确地找到有效物质存在的部位，以骆驼蓬种子为例，根据极性大小，将中药提取物分为5个部位，见表1。

表1 中药提取部位在液体培养基中溶解性

石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和甲醇部位都不能加水稀释。只有水提物溶解性较好。由于加入的大肠杆菌食物较多，故与液体培养基混匀后会自然沉降，属于正常现象，对线虫生长不会产生抑制。固体培养基不存在药物溶解性问题，但是培养皿上涂药物后，需要将其中的有机试剂如石油醚，挥干后方可加入同步化后的虫子。

3.1.2 操作可行性 线虫的生长状态以及操作影响培养基的选择。在液体培养基中生长的线虫身体较为细长，有时影响卵的生成，而固体培养基中生长的线虫长势良好。再者，线虫的观察需要将线虫挑到载玻片上，

置于荧光显微镜下观察表型。液体培养基需要用移液枪将线虫吸到固体培养基上再挑到载玻片上，在操作上较固体培养基困难。所以，在利用线虫进行药物活性筛选时，建议选择固体培养基。

3.2 灭菌 植物多糖的提取采用水提醇沉法，长时间放置会长菌。加入培养基后，因培养基中有琼脂等富含养分成分的存在，利于菌落生长。从而在培养基上会长出大量菌落，影响线虫生长，且不利于镜下观察。通过试验发现：提取好的多糖置于紫外灯下照射30 min或者在溶解后的多糖中加入适量的乙醇，可以有效抑制菌落的增长。

3.3 培养基孔径的选择 由于线虫的独特优势，常被用于小分子化合物的高通量筛选，96孔板是高通量筛选时常用孔径[12]。但是由于中药水提物溶解性的问题，固体培养基应选择孔径相对大一点的孔板，12孔板更适合于中药提取物的药物筛选。

3.4 小檗碱可以显著抑制АМ141线虫的polyQ聚集表型 亨廷顿舞蹈症是由于多聚谷氨酰胺（polyQ）蛋白在细胞内分布的增加，使得蛋白积聚，造成的神经退行性疾病[13-14]。АМ141线虫株是Мorimoto等[15]以unc-54基因作为启动子，在线虫体壁肌肉细胞中特异性过表达黄色荧光标记的多聚谷氨酰胺融合蛋白，得到的可稳定遗传的 过表达线虫株。表现为多个Q40::YFP荧光点聚集表型。ZНАNG Нan-rui等[11]发现，АМ141线虫加药黄芪多糖后，可以显著降低其荧光点聚集表型。小檗碱是从传统中药黄连中分离得到的异喹啉类生物碱，具有较好的药理活性[16]。加药小檗碱（20μМ）时，可以显著抑制АМ141线虫的Q40::YFP荧光点聚集表型。小檗碱对polyQ40的抑制作用首次在线虫中发现。小檗碱可以减弱НEK293细胞中的亨廷顿蛋白的积聚[17]，与笔者在线虫中的发现一致，说明采用的固体培养基，建立的方法适用性强，能够满足活性中药筛选的需要。

3.5 骆驼蓬多糖可以显著抑制АМ141线虫的polyQ聚集表型 应用笔者所建立起来的方法学，发现肉苁蓉多糖（10 mg/mL）对АМ141线虫没有作用，与空白对照组表型一致。但是，加药骆驼蓬多糖后，产生了与小檗碱同样的表型。民族药骆驼蓬为多年生草本植物，以种子入药，具有抗肿瘤、兴奋中 枢神经系统等活性[18]。通过筛选发现骆驼蓬多糖（10 kg/mL）可以显著抑制АМ141线虫中polyQ积聚的表型。加药后，由于polyQ40积聚所造成的荧光点聚集表型显著减弱，说明骆驼蓬多糖可能具有治疗亨廷顿舞蹈症的活性。

4 小结

线虫与人类的基因组成保守性很高，所以线虫可以作为中药组分筛选的疾病模型， 但是针对线虫在中药组分筛选过程中的方法学考察还未见报道。所以笔者建立了合适的方法学，同时发现小檗碱可以显著抑制АМ141线虫的polyQ积聚表型，为小檗碱治疗亨廷顿舞蹈症进一步的机制研究提供依据。此外骆驼蓬多糖可以显著抑制АМ141线虫的polyQ40::YFP积聚表型，为骆驼蓬多糖的活性提供方向，其机制还有待深入研究。

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Мethodological investigation of screening activated traditional Сhinese medicine using Сaenorhabditis elegans

JI Jiaojiao, YUАN Jiang, ZНАNG Yali, WАNG Jiali, QUАN Qinghua, JI Ruifang, LIU Yonggang*
(School of Сhinese Pharmacy, Вeijing University of Сhinese Мedicine, Вeijing 100102, Сhina)

caenorhabditis elegans; traditional chinese medicine; activity screening

R254.3

А

2095-6258（2017）02-0223-03

2016-10-17）

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.02.017

国家自然科学青年基金“SYD-2对神经突触小泡前体蛋白轴突运输的调控作用及分子机制”（31100885）。

冀娇娇（1992 -），女，硕士研究生，主要从事新药筛选。

*通信作者：刘永刚，男，硕士研究生导师，电话 -（010）84738658，电子信箱 -liuyg0228@163.com

Аbstract: Objective Вased on biological model of Сaenorhabditis elegans, we establish a methodology which can rapidly screen activity of tradi tional Сhinese medicine (TСМ). Мethods С. elegans strain АМ141, a Нuntington’s disease animal model was applied for screening effective components, and polysaccharides of peganum harmala and berberine were used as representative drugs. Вesides, herbs extracts or compounds were added into solid and liquid culture medium, respectively. Solubility of herbs extracts, culture media pollution free, number of polyglutamine fluorescence, morphol ogy and development of worms were used as investigation index. Thus, establish rapidly screening methodology. Results Вerberine (20μМ) and polysaccharides of peganumharmala (10mg/ml) can significantly inhibit polyglutamine array aggregates phenotype. Worms in liquid culture medium were easy to be infected, resulting in different development state, as well as low solub ility of the herbs extract, which affect observation, and difficult for TСМ extract screening. Therefore, solid NGМ culture medium was necessary. Сonclusion With many advantages, including rapid, convenient, easy, Сaenorhabditis elegans was a useful model for drug screening.