陈 彤 杨小龙 杨智玲

(甘肃省人民医院耳鼻咽喉头颈外科，甘肃 兰州 730000)

微小RNA-140-5p在老年下咽癌组织中的表达及对下咽癌细胞株FaDu迁移、侵袭力的影响

陈 彤 杨小龙 杨智玲

(甘肃省人民医院耳鼻咽喉头颈外科，甘肃 兰州 730000)

目的 探讨微小RNA-140-5p(MiR-140-5p)影响去整合素金属蛋白酶(ADAM)10表达对老年下咽癌组织和细胞的作用。方法 实时荧光定量RCR检测MiR-140-5p和ADAM10在41例老年下咽癌患者肿瘤组织及癌旁组织中的表达；利用转染技术分别上调MiR-140-5p表达，下调MiR-140-5p和ADAM10表达；采用Transwell细胞侵袭/迁移实验检测MiR-140-5p上调、MiR-140-5p下调、ADAM10下调对FaDu细胞迁移、侵袭的影响；Western印迹检测41对组织标本和FaDu细胞的ADAM10蛋白表达。结果 MiR-140-5p在下咽癌组织中明显下调，ADAM10 mRNA和蛋白在下咽癌组织中均明显上调。实验组FaDu细胞干扰ADAM10表达后，ADAM10表达水平明显低于阴性对照组(P<0.05)。Transwell实验显示，迁移和侵袭实验中MiR-140-5p上调组每视野下平均迁移细胞数均明显低于对照组，MiR-140-5p下调组均明显高于对照组(P<0.05)；ADAM10干扰实验组迁移和侵袭细胞数明显低于对照组(P<0.05)。ADAM10下调可逆转MiR-140-5p下调对细胞迁移和侵袭能力的促进作用。Western印迹显示，MiR-140-5p表达上调后，实验组ADAM10蛋白表达水平明显低于阴性对照组；MiR-140-5p表达下调后，实验组ADAM10蛋白表达水平明显高于阴性对照组。结论 MiR-140-5p在老年下咽癌组织中低表达，ADAM10高表达。MiR-140-5p抑制下咽癌细胞迁移、侵袭力可通过下调ADAM10蛋白表达实现，MiR-140-5p可作为下咽癌治疗的新靶点。

下咽癌；微小RNAs；去整合素金属蛋白酶10

目前高龄下咽癌患者逐渐增多，作为头颈部鳞状细胞癌中预后最差的恶性肿瘤，患者5年生存率仅为25%～30%〔1〕。高龄患者多合并循环、呼吸系统疾病，治疗较为困难。因此，深入研究下咽癌转移的分子机制，探索相关作用靶点，对下咽癌的防治具有重要意义。微小RNA(miRNA)可在肿瘤转移、侵袭过程中发挥致癌或抑癌基因的作用。MiR-140-5p是miRNA家族中一员，相关研究发现，MiR-140-5p在肝癌、舌癌组织中表达下调，扮演抑癌基因的角色〔2〕，但其在下咽癌中的作用机制仍未明确。去整合素金属蛋白酶(ADAM)10作为一种跨膜蛋白，在多个肿瘤组织中存在高表达，且与肿瘤的增殖、迁移明显相关。研究显示，MiR-140-5p可通过靶向抑制ADAM10的表达发挥抑制肿瘤转移的作用〔3〕，但在下咽癌中的可能调控机制鲜有报道。本次研究检测MiR-140-5p和ADAM10在老年下咽癌组织中的表达情况，并进一步以下咽癌细胞株FaDu为材料，探究MiR-140-5p对FaDu细胞迁移、侵袭力的影响，并分析其与预测靶点ADAM10的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 选取2014年6月至2015年12月在本院耳鼻喉头颈外科行手术治疗的老年原发性下咽鳞状细胞癌患者41例，均未接受放化疗，病灶无远处转移；本次研究经医院伦理委员会批准，患者或家属签署知情同意书。男38例，女3例，年龄60～75岁；原发部位梨状窝癌27例，环后癌10例，下咽后壁癌4例。每位患者均取下咽原发肿瘤组织和对应的癌旁组织(与肿瘤切缘距离>0.5 cm，病理检查显示无残余癌细胞)。人下咽癌细胞株FaDu购于南京科佰生物科技有限公司。

1.2 主要试剂与仪器 转染试剂Lipofectamine®3000(南京森贝伽生物科技有限公司)；MiR-140-5p过表达载体、si-ADAM10构建与测序(南京科维思生物科技有限公司)；MiR-140-5p引物、qRT-PCR试剂盒、Transwell小室(美国Genecopoeia公司)；兔抗人ADAM10抗体、小鼠抗人β-actin抗体(北京寰宇科创生物科技发展有限公司)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白测定试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)。荧光显微镜CKX41(日本OLYMPUS)；全自动细胞计数仪(美国Nexcelom)；Mx3005P荧光定量PCR仪(美国Agilent)。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养及转染 人下咽癌细胞株FaDu用含10%胎牛血清的DMEM培养基，在37℃、5%CO2细胞培养箱中每2～3 d传代一次，取对数期细胞进行实验。细胞计数后按每孔5×105接种于6孔板中，培养至细胞覆盖率≥70%时开始转染。

MiR-140-5p上调实验分组：①空白对照组：仅加入Lipofectamine®3000；②阴性对照组：加入过表达载体阴性对照组miRNA和Lipofectamine®3000；③MiR-140-5p上调组：加入has-MiR-140-5p过表达载体和Lipofectamine®3000。

MiR-140-5p下调分组：①空白对照组同上；②阴性对照组：加入阴性对照miRNA和Lipofectamine®3000；③MiR-140-5p下调实验组：加入MiR-140-5p inhibitor和Lipofectamine®3000；④MiR-140-5p下调和si-ADAM10共转染组：加入MiR-140-5p inhibitor、si-ADAM10 RNA、Lipofectamine®3000。

ADAM10干扰实验分组：①空白对照组同上；②阴性对照组：加入阴性对照siRNA和Lipofectamine®3000；③ADAM10干扰实验组：加入si-ADAM10 RNA和Lipofectamine®3000。

1.3.2 实时荧光定量RCR Trizol法提取标本组织和FaDu细胞中RNA，测定RNA纯度，使用All-in-OneTMqPCR检测试剂盒及Revert Aid First Strand cDNA试剂盒进行MiR-140-5p和ADAM10的反转录，均在常规PCR反应条件下进行40个循环，MiR-140-5p以U6为内参，ADAM10以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参。每个标本均检测3次，2-△△CT法计算相对表达量。

1.3.3 Western印迹 RIPA蛋白裂解试剂盒提取标本组织和FaDu细胞中的总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。95℃变性5 min，取30 μg行PAGE，湿法转移到聚偏氟丙烯(PVDF)膜，奶粉封闭后加入兔抗人ADAM10一抗(1∶1 000稀释)和小鼠抗人β-actin一抗(1∶3 000稀释)，4℃孵化过夜，加入二抗(1∶3 000稀释)，化学增强发光法(ECL)显色，荧光图像分析仪采集图像。

1.3.4 Transwell细胞侵袭/迁移实验 Matrigel胶与无血清DMEM培养基按1∶3比例配制基质胶，取20 μl抹于Transwell小室，细胞培养箱中孵育3 h，消化各组细胞，使用无血清培养基重悬细胞，上室加入100 μl含5×104个细胞的悬液，下室加入500 μl含10%FBS的DMEM培养液，小室放入培养箱中孵育24 h，用无菌棉签去除上室中的基质胶和残余细胞，光学显微镜下选取5个视野计数并拍照。迁移实验中小室不铺基质胶，其余步骤同侵袭实验。

2 结 果

2.1 MiR-140-5p、ADAM10 mRNA及蛋白在标本组织中表达 PCR检测显示，MiR-140-5p在下咽癌组织中表达水平为0.091±0.045，明显低于癌旁组织中0.155±0.097，差异有显著统计学意义(P<0.01)。以检测结果的中位数为临界值将41例下咽癌患者分为MiR-140-5p低表达组21例和高表达组20例。分析MiR-140-5p表达与临床病理特征关系显示，MiR-140-5p表达与性别无明显相关性，与肿瘤T分期和淋巴结转移N分期明显关联(P<0.05)，见表1。PCR检测显示，ADAM10 mRNA在下咽癌组织中表达水平为0.088±0.051，明显高于癌旁组织中0.046±0.023(P<0.01)。Western印迹检测显示，ADAM10蛋白在下咽癌组织中表达水平为0.992±0.263，明显高于癌旁组织中0.506±0.229(P<0.01)，见图1。

表1 临床病理参数与MiR-140-5p表达的关系(n)

图1 ADAM10蛋白在癌旁组织和下咽癌组织中表达情况

2.2 转染MiR-140-5p上调、MiR-140-5p下调与ADAM10干扰后检测has-MiR-140-5p和ADAM10的表达情况 PCR检测显示，MiR-140-5p上调组MiR-140-5p表达水平为0.145±0.025，明显高于阴性对照组的0.051±0.013(P<0.05)。MiR-140-5p下调组MiR-140-5p表达水平为0.011±0.003，明显低于阴性对照组的0.036±0.009(P<0.05)。空白对照组与阴性对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)。ADAM10干扰实验组ADAM10 mRNA表达水平为0.020±0.005，明显低于阴性对照组的0.691±0.018(P<0.05)；进一步行Western印迹检测显示，ADAM10干扰实验组蛋白表达水平为0.422±0.056，明显低于空白对照组1.016±0.321和阴性对照组1.150±0.406(P<0.01)，见图2。

图2 ADAM10干扰实验中各组ADAM10蛋白表达情况

A.迁移实验阴性对照组；B.迁移实验MiR-140-5p上调组；C.侵袭实验阴性对照组；D.侵袭实验MiR-140-5p上调组图3 Transwell实验观察MiR-140-5p上调对FaDu细胞迁移和侵袭力的影响(×100)

2.3 MiR-140-5p上调对FaDu细胞的影响 图3可见，迁移实验中，MiR-140-5p上调组每视野下平均迁移细胞数分别为95.444±18.159，明显低于阴性对照组的160.451±16.005(P<0.05)。侵袭实验中，MiR-140-5p上调组每视野下平均迁移细胞数分别为75.000±6.726，明显低于阴性对照组的103.557±10.747(P<0.05)。可见上调MiR-140-5p表达后肿瘤细胞迁移和侵袭力明显降低，其在下咽癌中起到抑癌基因作用。

2.4 MiR-140-5p对FaDu细胞中ADAM10蛋白表达的影响和MiR-140-5p下调对FaDu细胞的影响及与ADAM10蛋白表达的关系 MiR-140-5p表达上调后，实验组的ADAM10蛋白表达水平明显低于阴性对照组；MiR-140-5p表达下调后，实验组的ADAM10蛋白表达水平明显高于阴性对照组。提示MiR-140-5p可抑制ADAM10蛋白表达。使用FaDu细胞同时转染MiR-140-5p inhibitor和si-ADAM10 RNA时，发现si-ADAM10 RNA可在一定程度上逆转MiR-140-5p下调对ADAM10蛋白的升高作用。迁移实验中，对照组、ADAM10干扰实验组、MiR-140-5p下调组以及MiR-140-5p下调和si-ADAM10共转染组的迁移细胞数分别为：158.442±12.585、100.005±18.458、285.441±13.775、227.795±30.259，MiR-140-5p下调实验组迁移细胞数明显增加，ADAM10干扰实验组迁移细胞数明显降低(P<0.05)。侵袭实验中，对照组、ADAM10干扰实验组、MiR-140-5p下调组以及MiR-140-5p下调和si-ADAM10共转染组的迁移细胞数分别为：105.910±9.446、85.444±5.139、185.561±19.569、139.665±7.139，MiR-140-5p下调实验组迁移细胞数明显增加，ADAM10干扰实验组迁移细胞数明显降低(P<0.05)。而MiR-140-5p下调和si-ADAM10共转染实验组发现，ADAM10下调可逆转MiR-140-5p对FaDu细胞迁移和侵袭的促进作用。见图4～图6。

图4 上调MiR-140-5p对ADAM10表达的影响

1.对照组；2.MiR-140-5p下调组；3.ADAM10干扰组；4.MiR-140-5p下调和si-ADAM10共转染组图5 下调MiR-140-5p对ADAM10表达的影响

图6 Transwell实验观察下调MiR-140-5p表达和下调ADAM10对FaDu细胞迁移和侵袭力的影响(×100)

3 讨 论

异常表达的miRNA在肿瘤发生、发展中具有重要作用，其中MiR-140-5p在多种肿瘤中发挥抑癌基因的角色，例如：MiR-140-5p在肝癌组织中明显下调，上调其表达，可明显降低肿瘤的转移和侵袭力〔4〕。但目前关于MiR-140-5p对下咽癌发生、发展的调控机制仍未见系统报道。本次研究显示，MiR-140-5p在下咽癌组织中表达水平明显低于癌旁组织，并与肿瘤T分期和淋巴结转移分期之间存在明显相关性。通过转染技术上调MiR-140-5p在FaDu细胞中表达后，细胞的迁移、侵袭力明显降低；而上调其表达，细胞迁移、侵袭力明显增加。

ADAMs家族是Ⅰ型跨膜蛋白家族，广泛参与肿瘤的额病理过程〔5〕。ADAM10作为ADAMs家族一员，在多种肿瘤组织中高表达。研究显示，ADAM10在非小细胞肺癌组织中高表达，干扰ADAM10表达可降低其迁移和侵袭能力〔6〕。说明ADAM10在肿瘤发生、发展中发挥重要作用。本次研究显示，ADAM10在下咽癌组织中高表达，但其表达水平与临床病理特征无明显关联，可能与本次研究样本量较少有关，需进一步探讨。下调FaDu细胞中ADAM10表达水平可明显降低FaDu细胞的迁移、侵袭力，提示ADAM10作为致癌基因可影响下咽癌的发生、发展。

miRNA可调控40%以上的蛋白编码基因，探寻靶基因有助于明确miRNA在肿瘤转移、侵袭中的作用机制。依据miRNA配对原则使用靶基因数据库预测MiR-140-5p的靶基因，发现ADAM10与肿瘤组织恶性程度明显相关。基于上述研究结论，本次研究中将ADAM10作为MiR-140-5p的靶基因进一步探讨对老年咽癌的作用。结果显示，上调FaDu细胞中的MiR-140-5p表达，ADAM10蛋白表达明显降低；下调MiR-140-5p表达后ADAM10蛋白表达明显增加；同时下调ADAM10表达可有效逆转MiR-140-5p下调对下咽癌细胞迁移、侵袭能力的增强作用。提示MiR-140-5p可通过下调致癌基因ADAM10来抑制下咽癌细胞的迁移、侵袭力。

1 Xia CX，Zhu Q，Cheng Y,etal.Sonographic assessment of hypopharyngeal carcinoma：preliminary study〔J〕.J Ultrasound Med，2011；30(2)：217-25.

2 LoGalbo AM，Kuik DJ，Lips P，etal.A prospective longitudinal study on endocrine dysfunction following treatment of laryngeal or hypopharyngeal carcinoma〔J〕.Oral Oncol，2013；49(9)：950-5.

3 Fukada J，Shigematsu N，Takeda A,etal.Weekly low-dose docetaxel-based chemoradiotherapy for locally advanced oropharyngeal or hypopharyngeal carcinoma：a retrospective，single-institution study 〔J〕.Int J Radiat Oncol，2010；76(2)：417-24.

4 Suzuki K，Hayashi R，Ebihara M，etal.The effectiveness of chemoradiation therapy and salvage surgery for hypopharyngeal squamous cell carcinoma〔J〕.Jap J Clin Oncol，2013；43(12)：1210-7.

5 张濛川，韩 笑，安丽萍，等.P-5m八肽对肝癌HepG2细胞中MMP-2和MMP-9表达的抑制作用〔J〕.北华大学学报(自然科学版)，2016；17(2)：191-5.

6 Shen C，Xiang M，Nie C，etal.CD44 as a molecular marker to screen cancer stem cells in hypopharyngeal cancer〔J〕.Acta Otolaryngologica，2013；133(11)：1219-26.

〔2016-05-11修回〕

(编辑 袁左鸣)

陈 彤(1986-)，男，副主任医师，主要从事耳鼻咽喉头颈外科临床研究。

R73

A

1005-9202(2017)07-1588-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.010