于洋洋 梁明辉

(齐齐哈尔医学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

丹皮酚对肝癌细胞增殖凋亡及JAK-STAT信号通路的影响

于洋洋 梁明辉

(齐齐哈尔医学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

目的 探究丹皮酚(Pae)对肝癌细胞增殖凋亡及JAK-STAT信号通路的影响。方法 采用MTT法检测7.5、15、22.5、30、60 mg/L Pae 对HepG2细胞的抑制作用；采用流式细胞仪检测60 mg/L Pae作用HepG2细胞48 h后细胞凋亡情况；qRT-PCR法检测Pae处理对HepG2细胞Stat3、Stat5 mRNA的影响；Western印迹检测Pae处理JAK-STAT信号通路蛋白表达的影响。结果 Pae对HepG2细胞的抑制作用与培养时间和药物剂量呈依赖性，当Pae浓度为60 mg/L，处理细胞72 h时抑制效果最佳;流式细胞仪检测显示对照组细胞未出现大量凋亡，经60 mg/L Pae处理72 h后的HepG2细胞出现大量凋亡，处理组凋亡率明显高于对照组(P<0.05)。与对照组相比，不同浓度Pae作用HepG2细胞 48 h后，STAT3、STAT5基因表达量逐渐降低(P<0.05)，且与Pae剂量呈依懒性；Western印迹检测结果显示60 mg/L Pae 处理HepG2细胞48 h后，JAK1、JAK2、STAT3、STAT5蛋白表达量均显著低于对照组。结论 Pae能够抑制肝癌细胞HepG2增殖、诱导其凋亡，其机制可能与抑制JAK-STAT信号通路STAT3、STAT5基因和蛋白表达相关。

丹皮酚；HepG2细胞；凋亡；信号转导和转录活化蛋白

目前临床上治疗肝癌主要以手术和化疗为主，95%的患者在确诊时已为晚期，化疗药物虽然对患者病情具有一定控制作用，但其毒副作用较大〔1，2〕。丹皮酚(Pae)是从牡丹根部提取的化合物，具有消炎、解热、镇痛的疗效，研究表明Pae对肝癌细胞具有一定的抑制作用〔3〕。本研究旨在探讨Pae对肝癌细胞HepG2抑制凋亡及Janus蛋白酪氨酸激酶/信号转导和转录活化蛋白(JAK/STAT)信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 肝癌细胞HepG2细胞购于上海生物细胞研究所，本院冻存。丹皮酚注射液购于北京双鹤药业有限公司，批号：Z31020399，规格：2 ml/10 mg；胎牛血清(FBS)、DMEM培养基、胰蛋白酶购于杭州四季青有限公司，MTT、DMSO购于Sigma公司；链霉素和青霉素购于华北制药有限公司；2×SYBR Green Mix 订购于Takara公司；兔抗人JAK1、JAK2单克隆抗体购于Cell Signaling Technoloy 公司，鼠抗人STAT3单抗购于Origene 公司；鼠抗人β-actin单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记二抗山羊抗兔IgG购于中杉金桥公司。二氧化碳培养箱购于Thermo公司；流式细胞仪购于美国Thermo Scientific公司；全自动酶标仪购于Nano Drop公司；荧光定量PCR仪器购于Bio-Red公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 从超低温冰箱中取出冻存细胞，置于30℃水浴中使细胞解冻，加入5 ml磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，添加0.2%胰蛋白酶进行消化后于DMEM培养基中终止消化，加入10%FBS的DEME培养液，移液枪吹打培养液使细胞密度为106个/m3，置于5% CO2培养箱内培养，当细胞贴壁生长达到80%时加入胰蛋白酶消化，用DMEM培养基洗涤3次，800 r/min离心3 min，收集细胞。按照1∶3比例进行传代培养，第三代细胞用于后续研究。

1.2.2 MTT法检测Pae对HepG2细胞的抑制作用 将生长至对数期的HepG2细胞接种于96孔板中加入100 μl DEME培养液，将Pae用培养基进行稀释使浓度为7.5、15、22.5、30、60 mg/L，将稀释后的药物100 μl加入培养板，上述5组每组设置4个重复，同时以未加入Pae处理的孔作为对照组，分别培养24、48、72 h，培养结束后加入20 μl MTT，37℃反应4 h，去除细胞上清液后加入200 μl DMSO，37℃孵育20 min，于波长570 nm下测定各组的浓度，细胞存活率=OD实验组/OD空白组×100%。

1.2.3 流式细胞仪检测Pae对HepG2细胞凋亡的影响 以未进行Pae处理的细胞为对照组，以60 mg/L Pae 处理后的HepG2细胞为实验组细胞，培养使细胞液密度为103个/m3，37℃反应48 h后收集细胞，加入PBS溶液洗涤。对照组添加200 μl DMSO溶液，实验组加入100 μl DMSO和20 μl PI，避光反应20 min，采用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。

1.2.4 qRT-PCR法检测Pae处理对HepG2细胞STAT3、STAT5 mRNA的影响 收集处理后的HepG2细胞，参照细胞总RNA提取试剂盒进行细胞RNA提取，采用mRNA反转录试剂盒将mRNA翻转为cDNA，STAT3荧光定量引物序列：正义：5′-TTGGAGGCAGGAATAGG-3′ 反义：5′-TGGCTTGACGGGTTGAT-3′，STAT5引物序列：正义：5′-TTTGGAGGCAGGAATAGG-3′反义：5′-TGGCTTGACGGGTTGAT-3′，以β-actin 为内参，序列：正义5′-TCCACCGCAAATGCTTCTAG-3′，反义：5′-TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3′。20 μl反应体系：10 μl 2×SYBR Green Mix，正义、反义引物各1 μl，H2O 7 μl，10×cDNA模板1 μl，反应程序95℃ 3 min，94℃ 10 s、56℃ 20 s，72℃ 2 min，30个循环，72℃ 10 min，95℃ 10 s。利用CFX manager 3.0软件进行CQ值分析，以β-actin作为内参基因，按照2-ΔΔCQ算法进行基因相对定量分析。

1.2.5 Western印迹检测JAK-STAT信号通路蛋白的表达 收集处理后的细胞液提取细胞总蛋白，BCA法测定提取后蛋白的浓度，配制8%、12%的分离胶与浓缩胶，取30 μg蛋白上样，蛋白Marker 5 μl，浓缩胶电压设置为80 V，分离胶电压为120 V，反应结束将蛋白凝胶转移至PVDF膜上(JAK1和JAK2：200 mA，100 min；STAT3：90 V，120 min)加入脱脂牛奶封闭4 h，加入一抗(兔抗人JAK1、JAK2，鼠抗人STAT3单抗)4℃震荡过夜，加入PBS溶液清洗3次，10 min/次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温下反应2 h，加入PBS溶液清洗3次，10 min/次。将蛋白凝胶用EXL发光后，在暗室中曝光，利用凝胶成像仪对Western印迹产生的条带进行定量分析。

1.3 统计学分析 采用SPSS17.0软件行方差分析。

2 结 果

2.1 Western印迹检测JAK-STAT信号通路蛋白的表达 用60 mg/L Pae 处理HepG2细胞48 h后，JAK1、JAK2、STAT3、STAT5蛋白表达量均显著低于对照组。见图1。

A.未经Pae处理； B：60 mg/L Pae 处理48 h图1 Western印迹检测结果

2.2 MTT法检测Pae对HepG2细胞的抑制作用 不同浓度Pae对HepG2细胞均有一定抑制作用，Pae对HepG2细胞的抑制作用与培养时间和药物剂量呈依赖性，在相同浓度下，随着培养时间的延长，细胞的抑制率逐渐增加，相同培养时间内，随着剂量的增加，细胞的抑制作用逐渐增强。当Pae浓度为60 mg/L，处理细胞72 h时，抑制效果最佳。见图2。

图2 HepG2细胞生长抑制曲线

2.3 流式细胞仪检测HepG2细胞的凋亡 对照组细胞未出现大量凋亡，经60 mg/L Pae处理72 h后的HepG2细胞出现大量凋亡，处理组凋亡率(80%)明显高于对照组(10%)(P<0.05)。

2.4 qRT-PCR法检测Pae处理对HepG2细胞STAT3、STAT5 mRNA的影响 选取7.5、15、22.5、30 mg/L Pae 作用HepG2细胞48 h后，与对照组(0.90，0.81)相比，随着处理浓度的增加，STAT3、STAT5基因表达量逐渐降低(7.5、15、22.5、30 mg/L Pae处理后细胞STAT3、STAT5 mRNA表达量分别为0.80，0.75；0.70，0.60；0.60，0.48；0.50，0.41；P<0.05)，与Pae剂量呈依懒性。

3 讨 论

肝癌的发生发展是由多因素、多基因、多步骤共同参与而导致的结果，探究其发生原因主要与以下几方面相关：(1)癌基因的激活或抑癌基因的失活；(2)肝细胞抗原结构发生变化；(3)信号通路被激活使凋亡机制的失活；(4)细胞增殖异常、血管内皮生长因子受到外源刺激〔4～6〕。

牡丹皮性寒、味苦有清热解毒、活血化瘀的功效，具有保肝、消炎、抗癌、保护神经、抗过敏性哮喘等作用，Pea是从牡丹皮中提取的有效化学成分〔7〕，近期有较多文献报道Pae能够通过多种途径抑制控制肿瘤细胞的增殖，动物实验表明Pae能够通过升高血清中SOD、GSH-Px抑制脂质过氧化进而抑制癌细胞增殖〔8〕，体外实验表明Pea能够抑制乳腺癌细胞以及宫颈癌细胞增殖〔9〕。此外，Pae与姜黄素联合使用后抗肿瘤活性得到进一步提高，在Pae对肝癌MHCC97的抑制机制实验结果中显示Pae通过降低AKT表达、升高PTNE基因表达而抑制癌细胞增殖〔10，11〕。本研究结果表明Pae能够显著抑制肝癌细胞增殖，随着PAE处理浓度的增加以及培养时间的延长其抑制作用逐渐增强，而且进一步流式细胞检测也显示经Pae处理后细胞出现大量凋亡，表明Pae具有诱导肝癌细胞凋亡的作用。

JAK-STAT信号通路在肝癌的发生中发挥重要作用，在正常情况下JAK和STAT通过反馈调节模式维持相对稳定状态，机体产生病变后激活JAK蛋白磷酸化，激活信号传导途径，使STAT蛋白中的酪氨酸残基发生磷酸化，活化后形成同源二聚体进入细胞核中与相应靶基因结合从而调控其进行表达。相关研究表明STATS蛋白家族中的大部分成员对细胞增殖、凋亡以及细胞免疫方面产生一定影响。研究表明STAT3、STAT5被异常激活后，能够引起下游靶基因如Survivin、Bcl-2、caspases、c-myc、Cyclin D1等的异常表达，这些基因均与细胞增殖凋亡等病理过程相关〔12〕。有研究表明STAT3在乳腺癌、肝癌、淋巴癌、肺癌中均大量表达，而正常组织中表达量较低〔13〕。在研究JAK-STAT信号通路与肝癌患者预后关系中结果显示JAK-STAT途径中JAK、STAT蛋白过度表达不利于患者预后〔14〕。有文献报道JAK化学阻断剂能够诱导白血病细胞凋亡，而不影响正常细胞〔15〕。本研究结果显示使用Pae处理后HepG2细胞中STAT3、STAT5基因表达量降低，提示这两者基因的表达与肝癌细胞抑制相关，进一步从蛋白水平上研究结果显示JAK1、JAK2、STAT3蛋白表达量下降，这与相关文献〔13〕报道Pae能诱导BEL-7402细胞凋亡相符，提示JAK-STAT信号通路在肝癌发展中占有重要作用，Pae处理后能够通过影响JAK-STAT信号通路蛋白表达，抑制肝癌细胞增殖。

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〔2016-11-30修回〕

(编辑 郭 菁)

齐齐哈尔市科技计划指令性项目(XCP-201401)

梁明辉(1975-)，男，硕士，高级实验师，主要从事医学影像学研究。

于洋洋(1989-)，男，主要从事临床医学研究。

R285.5

A

1005-9202(2017)07-1591-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.011