闻 颖，周 莹，孙翠明，王彦丽，刘 沛

抗巨细胞病毒治疗对获得性免疫缺陷综合征合并巨细胞病毒血症患者外周血凋亡相关因子水平的影响*

闻 颖，周 莹，孙翠明，王彦丽，刘 沛

（中国医科大学附属第一医院 传染科，辽宁 沈阳 110001）

目的 探讨抗巨细胞病毒（CMV）治疗对获得性免疫缺陷综合征（简称艾滋病）合并CMV血症患者的外周血凋亡相关因子水平的影响。方法 选取2014年1月1日～12月31日中国医科大学附属第一医院确诊住院的外周血CMVIgG阳性的男性艾滋病患者（CD4+T＜200个/μl）共34例（排除合并CMV视网膜炎者）。非随机对照分为3组，阴性CMV血症组（n=11）、阳性CMV血症非抗CMV组（n=11）、阳性CMV血症抗CMV组（n=12）。同时设立性别、年龄匹配的12例健康人做对照。同时全部入组患者于第3周末接受高效抗逆转录病毒治疗。在随访12月末时，评价各组CD4+T细胞计数、CMV视网膜炎的发生率；评价外周血凋亡相关因子浓度的变化及组间差异。结果 与健康对照比较，艾滋病患者Fas、FasL、TRAIL、TNF-α水平升高（t=-3.369、-2.683、-4.321和-5.321，P=0.012、0.033、0.009和0.003），而Bcl-2水平降低（t=-4.321，P=0.001）。基线时3组年龄、HIVRNA载量、CD4+T细胞计数、WHO临床分期差异无统计学意义；非抗CMV组与抗CMV组CMVDNA载量差异无统计学意义。与非抗CMV组比较，抗CMV组与阴性CMV血症组12个月时CD4+T细胞计数升高（F=4.260，P=0.013和0.020）；外周血Bcl-2（F=3.621，P=0.009和0.006）、FasL（F=2.891，P= 0.024和0.002）、TNF-α浓度降低（F=4.912，P=0.003和0.001）；而抗CMV组与阴性CMV血症组组间未见差异。与基线水平比较，艾滋病患者随访12个月时Fas、FasL和TRAIL水平下降（t=2.579、2.194和2.274，P= 0.015、0.035和0.030）。观察期内无CMV视网膜炎发生，无死亡病例，无HIV病毒学反弹发生。结论 抗CMV治疗促进艾滋病合并CMV血症患者的CD4+T细胞计数增长，这可能与外周血Bcl-2、FasL和TNF-α浓度降低有关。此外，高效抗逆转录病毒治疗本身也可以降低Fas、FasL和TRAIL水平。

获得性免疫缺陷综合征；巨细胞病毒血症；抗巨细胞病毒治疗；凋亡

高效抗逆转录病毒治疗（highly active antiretroviral therapy，HAART）在抑制人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）复制同时引起CD4+T细胞上升，使艾滋病（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS）的病死率明显下降。本研究前期研究发现，人巨细胞病毒（Cytomegalovirus，CMV）感染是导致HAART后CD4+T细胞增长不良的重要因素[1-2]。APPAY等[3]也报道，启动HAART时老龄与CMV共感染是HAART后免疫重建不良的原因。HIV/CMV共感染在中国十分普遍，更为重要的是CMV感染可加速HIV进展[4]。阐明CMV阻遏HAART后CD4+T细胞增长的机制及合理防治CMV感染，对改善HIV/CMV共感染者预后有重要意义[5]。活化T细胞的细胞死亡方式主要有2种：活化诱导的细胞死亡（activation-induced cell death，AICD）及活化T细胞自发死亡（T cell autonomous death，ACAD）。有文献表明CMV特异性CD8+、CD4+T细胞可通过AICD及ACAD引起免疫T细胞凋亡[6-7]。在HIV婴幼儿感染者中，急性CMV感染导致CD4+T细胞减少通过Fas途径诱导CD4+T细胞凋亡[8]。在HIV成人感染者中，目前尚缺乏CMV共感染与T细胞凋亡相关机制的研究报道。本文动态评估艾滋病患者基线、HAART后12个月的CD4+T细胞计数、外周血凋亡相关因子（Fas、FasL、TRAIL、TNF-α和Bcl-2）浓度的动态变化，明确抗CMV治疗（静脉滴注更昔洛韦）对上述指标的影响，为其参与促进T细胞免疫重建的抗凋亡机制提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年1月1日～12月31日在中国医科大学附属第一医院确诊收治的男性艾滋病患者。纳入标准：男性HIV感染者，年龄18～70岁，同时满足3项条件：①CD4+T＜200个/μl。②外周血CMVIgG阳性。③无CMV视网膜炎。阳性CMV血症定义：CMVDNA＞500 copies/ml。共纳入患者34例，年龄20～67（40.13±14.25）岁，非随机对照分组：阴性CMV血症组（n=11）、阳性CMV血症非抗CMV组（n=11）、阳性CMV血症抗CMV组（n=12）。随访时间12个月。同时设立性别、年龄匹配的12例外周血CMVIgG阳性的健康人做外周血凋亡相关因子检测对照。已经取得全部患者的知情同意。

1.2 治疗方法

全部患者均针对合并的其他机会性感染给予相应治疗。阳性CMV血症抗CMV组，应用更昔洛韦注射液静脉滴注（单次剂量5 mg/kg，2次/d）治疗5周；同时患者于第3周末行HAART治疗（方案：拉米夫定+替诺福韦酯+依非韦伦）。

1.3 检测方法与评价指标

1.3.1 检测方法 用EDTA采血管分别收集基线、12个月外周血标本，2 000 r/min离心10 min，置入-70℃冰箱冷冻保存。应用上海西塘实业有限公司的酶联免疫吸附试剂盒检测人凋亡相关因子（Fas，CD95）、人凋亡相关因子配体（FasL）、TNF相关的凋亡诱导配体（TNF related apoptosis inducingligand，TRAIL）、人肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）、人B细胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2）水平。血浆CMV DNA定量检测按照人CMV核酸扩增荧光定量检测试剂盒（中山大学达安基因股份有限公司产品，批号：S20060056）。流式细胞仪（美国，BD公司，Aria)进行T淋巴细胞亚群分析（032046-D，北京赛驰生物科技有限公司）。HIV RNA定量检测采用全自动病毒载量测定仪（Roche公司，COBAS），按照co-BAS TaqMan HIV-1 Test v2.0试剂盒操作。

1.3.2 评价指标 评价患者基线CMVDNA载量、HIVRNA载量、CD4+T细胞计数、WHO临床分期有无差异。随访12个月末时评价患者CD4+T细胞计数、CMV视网膜炎的发生率、死亡率的差异。评价5种外周血可溶性凋亡相关因子（Fas、FasL、TRAIL、TNF-α和Bcl-2）的浓度的动态变化及组间差异。于基线、12个月时各评估患者眼底1次。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 13.0统计软件，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，3组间计量资料比较方差齐者应用单因素方差分析，否则应用非参数检验；两组间比较用两独立样本t检验。患者治疗前后计量资料比较用配对t检验；3组间计数资料的比较用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床转归

抗CMV组中全部病例均于4周内出现CMV DNA阴转，有3例因外周白细胞减少，曾予口服利可君提升白细胞治疗。全部病例于第3周末行HAART治疗（方案：拉米夫定+替诺福韦酯+依非韦伦）。观察期内两组均无CMV视网膜炎发生。没有死亡病例，无HIV病毒学反弹发生。

2.2 基线时各组指标比较

34例患者中，29例CD4+T细胞计数＜100个/ μl(占85.29%)。其中阴性CMV血症组（n=11）、阳性CMV血症非抗CMV组（n=11）、阳性CMV血症抗CMV组（n=12）。3组在年龄、HIVRNA载量、CD4+T细胞计数、WHO临床分期比较差异无统计学意义（F=0.621、0.756和0.549，P=0.532、0.433和0.645；χ2=0.215，P=0.323）。CMV DNA载量在阳性CMV血症非抗CMV组与阳性CMV血症抗CMV组两组间差异无统计学意义（t=-1.696，P=0.315）。见表1。

与健康对照比较，艾滋患者基线Fas、FasL、TRAIL和TNF-α水平升高（t=-3.369、-2.683、-4.321和-5.321，P=0.012、0.033、0.009和0.003），而Bcl-2水平降低（t=-4.321，P=0.001）（见表2）。基线时各组Fas、FasL、TRAIL、TNF-α和Bcl-2水平差异无统计学意义（F=0.332、0.733、0.064、1.522和1.853，P=0.720、0.488、0.938、0.234和0.098）。见表3。

2.3 12个月时各组指标比较

与阳性CMV血症非抗CMV组比较，抗CMV组与阴性CMV血症组12个月时有较高的CD4+T细胞计数（F=4.260，P=0.013和0.020）；同时外周血Bcl-2浓度降低（F=3.621，P=0.001、0.000和0.006）；FasL的浓度降低（F=-2.891，P=0.002、0.024和0.002）；TNF-α的浓度降低（F=4.912，P=0.000、0.003和0.001）（见表3）；而抗CMV组与阴性CMV血症组组间在 12个月时的 CD4+T细胞计数、Bcl-2、FasL、TNF-α 的浓度未见差异（P=0.403、0.521、0.216和0.198）。各组Fas和TRAIL在12个月时差异无统计学意义（F=0.843和0.992，P=0.501和0.482）。

2.4 基线与12个月时指标比较

全部患者在12个月时HIVRNA载量、CMV DNA载量转阴，CD4+T细胞计数较基线时上升，但仍有13例患者CD4+T细胞计数＜100个/μl（占38.24%）。与基线水平比较，艾滋病患者随访12个月时Bcl-2、Fas和FasL水平下降（t=2.579、2.194和2.274，P=0.015、0.035和0.030），而TNF-α和TRAIL浓度的变化差异无统计学意义（t=1.950和-1.541，P=0.060和0.133）。见表4。

表1 艾滋病患者基线各组基线临床指标比较 （x±s）

表2 两组基线外周血可溶性凋亡相关因子水平比较 （pg/ml，x±s）

表3 艾滋病患者基线、12个月时外周血可溶性凋亡相关因子水平组间比较 （pg/ml，x±s）

表4 艾滋患者基线与12个月时外周血可溶性凋亡相关因子水平比较 （pg/ml，x±s）

3 讨论

本研究结果提示，与健康对照比较，艾滋病患者外周血 Fas、FasL、TRAIL和 TNF-α 水平升高，Bcl-2水平降低，再次证实细胞凋亡是HIV感染T细胞丢失的一个重要原因；HAART治疗可以降低Fas、FasL和TRAIL水平，再次证实HAART治疗引起的细胞免疫重建伴随着T细胞凋亡的减少；抗CMV治疗促进艾滋病合并CMV血症患者的CD4+T细胞计数增长，这与前期研究结果一致，其机制可能与外周血凋亡因子Bcl-2、FasL、TNF-α浓度降低有关，提示其促进T细胞免疫重建的抗凋亡机制。HUNT[9]曾报道，其与降低异常免疫活化有关。

CMV特异性T细胞免疫介导的免疫控制在CMV感染中起着决定性作用，该点已经在器官移植受者得到广泛证实[10]。由于抗CMV治疗有助于CMV特异性T细胞免疫功能的恢复，因此在器官移植领域已将对CMV特异性免疫的监测决策启动/停止抗CMV治疗列入指南。而针对HIV/CMV感染的患者，这方面研究结果较少，目前仅仅涉及对CMV视网膜炎的治疗。以往的文献曾观察HAART治疗对巨细胞特异性T细胞免疫的影响。HAART治疗前，产生IFN-r的CMV特异性CD4+T几乎消失；CMV特异性CD8+T细胞数量虽然无明显减少，但产生IFN-r的细胞比例明显下降，而产生穿孔素、颗粒酶B的细胞比例上升；HAART治疗后，CMV特异性的T细胞免疫出现不完全的重建，抗原刺激后的T细胞增殖反应与产生细胞因子能力之间很不一致[11]。该结果提示，仅仅HAART治疗难以满意重建CMV特异性的T细胞免疫，而后者与艾滋病患者的预后息息相关。因此，对伴有CMV血症的艾滋病患者，明确抗CMV治疗是否有助于改善巨细胞特异性T细胞免疫以及探索相关机制具有重要意义。

艾滋病是一种T细胞过度凋亡的疾病，其机制涉及多种凋亡基因及信号转导途径的激活[12]。一种是死亡受体途径，属于外源性凋亡途径，如Fas、TNF受体1和TRAIL受体等，可被TNF家族成员FasL、TNF-α和TRAIL等激活，其中Fas是AICD的主要调节者。另一种是线粒体-细胞色素C释放途径，属于内源性凋亡途径，如Bcl-2家族[13]。随访中发现，抗CMV治疗组FasL、TNF-a浓度是降低的，揭示了其参与了外源性抗凋亡机制。虽然有文献指出TRAIL参与了旁观者T细胞的凋亡[14]，而在本研究中TRAIL浓度组间差异无统计学意义，未提示其参与抗CMV治疗抗凋亡机制。Bcl-2主要发挥抗凋亡机制。虽然与健康对照比较，HIV患者Bcl-2水平是降低的，该点与先前研究一致。但本研究却发现, HAART治疗后Bcl-2水平降低；抗CMV治疗组Bcl-2水平降低的更加明显，其原因可能为：Bcl-2抑制凋亡的作用不是万能，凋亡途径对Bcl-2水平敏感与否与细胞类型有关，而该差异取决于线粒体是否参与这种凋亡途径[15]；Bcl-2不是HAART治疗与抗CMV治疗抗凋亡机制中的参与因素。

综上所述，抗CMV治疗促进艾滋病合并CMV血症患者的CD4+T细胞计数增长，其机制可能与外周血凋亡因子Bcl-2、FasL和TNF-α浓度降低有关，进一步明确其抗凋亡的具体途径，即Fas途径、TNF受体1途径和Bcl-2途径等是下一步的研究方向。

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（张西倩 编辑）

Effect of anti-cytomegalovirus therapy on blood levels of apoptosisrelated factors in patients with AIDS and cytomegalovirus viremia*

Ying Wen,Ying Zhou,Cui-ming Sun,Yan-li Wang,Pei Liu
(Department of Infectious Diseases,the First Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang,Liaoning 110001,China)

Objective To explore the effect of anti-cytomegalovirus therapy on the blood levels of apoptosisrelated factors of patients with acquired immunodeficiency syndrome(AIDS)and cytomegalovirus(CMV)viremia. Methods The study was carried out in the 34 male hospitalized patients who were newly diagnosed as AIDS in the First Affiliated Hospital of China Medical University from January 1,2014 to December 31,2014.The patients were divided into CMV viraemia negative group(n=11),CMV viraemia positive non-treatment group(n=11),and CMV viraemia positive treatment group(n=12).Meanwhile 12 healthy controls were included.The baseline age,CMVDNA,HIV-RNA,CD4+T cells and World Health Organization clinical stages were evaluated in the groups.Patients received highly active antiretroviral therapy at the end of the 3rd week.CD4+T cell count,the incidence of CMVretinitis and the blood levels of apoptosis-related factors were evaluated at the end of the 12th month.Results Compared with the health controls,the levels of Fas,FasL,TRAIL and TNF-α increased in the patients with AIDS (t=-3.369,-2.683,-4.321 and-5.321;P=0.012,0.033,0.009 and 0.003 respectively),while the level of Bcl-2 was lowered(t=-4.321,P=0.001).There was no significant difference in the baseline age,HIV-RNA load,CD4+T cell count or WHO clinical stages among the three disease groups.There was no difference in the CMV-DNA load between the CMV non-treatment group and the CMV treatment group.At the end of the 12th month,compared with the CMV non-treatment group,the CD4+T cell count increased (F=4.260,P=0.013 and 0.020),lower levels of Bcl-2(F=3.621,P=0.009 and 0.006),FasL(F=2.891,P=0.024 and 0.002)and TNF-α(F=4.912,P=0.003 and 0.001)were found in both the CMV treatment and CMV negative groups;while there were no differences between the CMV treatment group and the CMV negative group.Compared with levels at baseline,the levels of Fas, FasL and TRAIL were decreased at the end of the 12th month in the AIDS patients(t=2.579,2.194 and 2.274;P= 0.015,0.035 and 0.030).There was no occurrence of CMV retinitis,death or virological rebound.Conclusions Anticytomegalovirus therapy is beneficial to the increment of CD4+T cells in patients with AIDS and CMV viremia,which may be due to obvious decrease in blood levels of Bcl-2,FasL and TNF-α.Furthermore,the levels of Fas,FasL and TRAIL are also decreased after highly active antiretroviral therapy.

acquired immunodeficiency syndrome;cytomegalovirus viremia;anti-cytomegalovirus therapy; apoptosis

R512.91

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.04.009

1005-8982（2017）04-0046-05

2016-04-19

辽宁省自然科学基金（No：2013021013）