赵燕星，苏殿三，陈 杰，王祥瑞

（1.中国中医科学院广安门医院 麻醉科，北京 100053；2.上海交通大学医学院附属仁济医院 麻醉科，上海 200127）

基础研究·论著

异氟醚对阿尔茨海默病APPswe/PS1dE9双转基因型小鼠学习记忆能力的影响*

赵燕星1，苏殿三2，陈 杰2，王祥瑞2

（1.中国中医科学院广安门医院 麻醉科，北京 100053；2.上海交通大学医学院附属仁济医院 麻醉科，上海 200127）

目的 研究异氟醚对阿尔茨海默病APPswe/PS1dE9双转基因型小鼠学习记忆能力的影响。方法将转基因小鼠分为转基因异氟醚组（Tg-iso组）及转基因空白对照组（Tg-con组），野生型分为野生异氟醚组（Wt-iso组）及野生空白对照组（Wt-con组）。Tg-iso组及Wt-iso组于7个月龄行异氟醚麻醉，吸入1.1%异氟醚2 h，连续5 d。同时Tg-con及Wt-con组吸入30%氧气与70%氮气的混合气体。麻醉后48 h各组行水迷宫实验，麻醉后5个月各组行Y迷宫实验。结果 7个月龄时：与Wt-con组比较，Wt-iso组的潜伏期缩短（P= 0.013）；与Tg-con组比较，Tg-iso组的潜伏期缩短（P=0.043）；各组间空间探索实验目标象限时间和路程百分比的差异无统计学意义（P=0.392和P=0.300）。12个月龄时：与Tg-con组比较，Wt-con组和Tg-iso组辨别错误次数明显减少（P=0.044和P=0.020）。结论 短时间重复吸入低浓度的异氟醚不增加阿尔茨海默病APPswe/PS1dE9双转基因型小鼠及野生对照型小鼠近期及远期学习记忆能力障碍的风险，反而在一定程度上有减轻的作用。

学习记忆；异氟醚；APPswe/PS1dE9双转基因小鼠；Y迷宫；Morris水迷宫

随着人口老龄化的到来，阿尔茨海默病（alzheimer's disease，AD）的发病率也随之增高。部分患者，特别是老年患者于手术和麻醉后会出现术后认知功能障碍，两者主要表现为认知障碍和记忆力损害及日常生活能力下降。那么，手术或麻醉是否会加速AD患者认知功能的改变不得而知。针对AD的发病机制存在多种模型，其中转基因小鼠模型以模拟AD患者主要病理改变，如老年斑、神经元纤维缠结，成为研究AD发病机制和药物筛选的理想模型。本实验采用阿尔茨海默病APPswe/PS1dE9双转基因小鼠模拟以上AD病理机制，以观察重复吸入异氟醚在不同时期对其学习记忆能力的影响，从而为临床上阿尔茨海默病患者实施麻醉提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

阿尔茨海默病APPswe/PS1dE9双转基因小鼠，由中国科学院神经科学研究所段树民院士馈赠。

1.2 试剂与仪器

引物（上海英骏公司合成），Taq酶（上海申能博彩公司），异氟醚（美国雅培公司），30%氧气O2与70%氮气N2的混合气体。主要仪器：聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪，电泳仪，Morris水迷宫视频分析系统2.0（上海吉量软件科技有限公司），Y迷宫，Datex-Ohmeda麻醉气体监测仪。

1.3 实验方法

1.3.1 转基因小鼠的繁殖 C57BL/6J雌鼠与C3H/ HeJ雄鼠交配得到F1代，再将F1代与3个月龄的阿尔茨海默病APPswe/PS1dE9双转基因小鼠交配得到F2代。由于APPswe和PS1dE9是连锁遗传，按照孟德尔遗传规律，F2代50%为阿尔茨海默病APP swe/PS1dE9双转基因型小鼠。

1.3.2 转基因小鼠的基因型鉴定 F2代小鼠剪尾，提取鼠尾DNA，紫外分光光度计分析DNA浓度，PCR扩增目的基因APP、PS1，琼脂糖凝胶电泳分析。PCR反应中所用的具体序列为：APP正向引物（P1）：5'-G ACTGACCACTCGACCAGGTTCTG-3'，反向引物（P2）：5'-CTTGTAAGTTGGATTCTCATATCCG-3'；PS1正向引物（P3）：5'-GTGGATAACCCCTCCCCCAGCCTAG ACC-3'，反向引物（P4）：5'-AATAGAGAACGGCAGG AGCA-3'。Prp基因作为内参。PCR的反应体系为20μl，其中：10×PCR buffer 2μl，25 mmol氯化镁MgCl21.6μl，2 mmol dNTP 2μl，DNA 100 ng，引物10mmol P1、P2各0.5μl（或P3、P4），Taq 3～5 u，另PS1基因加50%甘油4μl，加水补足20μl。APPswe基因反应条件：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，69℃退火60s，72℃延伸60 s，共35次循环后72℃再延伸3 min，PCR产物长度约为300 bp。PS1基因反应条件：94℃预变性15 min，94℃变性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸90 s，共40次循环后72℃再延伸5 min，PCR产物长度约为1 200 bp。

1.3.3 实验分组及麻醉方法 繁殖的小鼠根据是否含APP和PS1基因分为转基因组（以下称为Tg）和野生对照组（以下称为Wt），再将Tg小鼠分为转基因异氟醚组（Tg-iso）及转基因空白对照组（Tg-con），将Wt小鼠分为野生异氟醚组（Wt-iso）及野生空白对照组（Wt-con）。于7个月龄对Tg-iso组及Wt-iso组行异氟醚麻醉，吸入1.1%异氟醚和O2/N2（FiO230%）的混合气体，连续5 d，2 h/d。同时Tg-con及Wt-con组吸入O2/N2（FiO230%）的混合气体。氧气流量2 L/min。Datex-Ohmeda持续监测异氟醚浓度。电热毯加热，维持小鼠体温（37±0.5）℃（肛温）。

1.3.4 Morris水迷宫 小鼠于7个月龄异氟醚麻醉后48 h行水迷宫实验。水迷宫由直径100 cm，高50 cm的水池组成，分为4个象限，水位没过逃生平台1 cm，水温（25±2）℃。水池底及四壁均涂成黑色使平台不可见。采用Morris水迷宫视频分析系统2.0监测并记录小鼠的游泳轨迹。Morris水迷宫实验程序包括：①定位航行实验用于测量小鼠获取空间学习记忆的能力。历时4d，4次/d，每次训练间隔15 s。将小鼠从4个入水点随机地放入水中，通过自动录像系统记录小鼠90 s内找到平台的时间（逃避潜伏期）。找到平台后休息30s，如果90 s内找不到平台，逃避潜伏期记录为90 s。然后人为地将小鼠诱导至平台休息30s。②空间探索实验用于测量小鼠学会寻找平台后，保持对平台空间位置记忆的能力。即训练第5天拆除平台，将小鼠从1、3象限面向池壁放入水中，记录60 s内小鼠在原目标象限的路程和时间百分比，两次测量取平均值。认知测试过程中保持实验室内灯光、物品等空间参照物摆放位置不变，以排除环境干扰。

1.3.5 Y迷宫 小鼠于12个月龄时行Y迷宫实验。测试前在迷宫中适应5 min，测试时调节刺激电压以保证小鼠在5 s内进入安全臂。小鼠在5 s内进入安全臂不会受到电击，为正确反应，否则为错误反应。每7 s进行1次电击，直到进入安全臂。记录训练次数、正确次数和辨别错误次数。

1.4 统计学方法

采用SPSS16.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用重复测量的双因素方差分析（两个控制因素分别为实验日期与实验分组）比较定位航行实验所测的游泳速度、游泳路程及潜伏期。采用单因素方差分析比较定位航行实验每天的游泳速度、游泳路程及潜伏期，以及空间探索实验所测的时间与路程百分比，以及Y迷宫的训练次数、正确次数和辨别错误次数，其中组间两两比较采用LSD法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠的繁殖及基因型鉴定结果

F2代小鼠91只，其中转基因型49只，野生型42只。PCR结果显示 49只小鼠出现APP，PS1阳性条带，见图1，与预计扩增目的基因大小一致（APP 300 bp，PS1 1 200 bp）。分别将转基因型49只和野生型42只随机分为异氟醚组（Tg-iso组、Wt-iso组）和对照组（Tg-con组、Wt-con组），12个月龄存活的Tg-iso组20只、Tg-con组23只、Wt-iso组16只、Wt-con组18只。

2.2 Morris水迷宫结果

游泳速度是反映各组小鼠运动能力的指标。定位航行实验期间各组游泳速度比较，差异无统计学意义（P=0.525）。见图2。

随着训练时间的延长，各组小鼠的潜伏期逐渐缩短。定位航行实验第3天，各组潜伏期比较，差异有统计学意义（F=3.781，P=0.015）。整个过程Wt-iso组的潜伏期最短，Tg-con组的潜伏期最长（F=4.944，P=0.004）。与Wt-con组比较，Wt-iso组的潜伏期缩短（P=0.013），与Tg-con组比较，Tg-iso组的潜伏期缩短（P=0.043）。见图3。

随着训练时间的延长，除Tg-con组游泳路程无明显变化，其余各组小鼠的游泳路程逐渐缩短，但各组比较差异无统计学意义（F=2.727，P=0.052）；定位航行实验第3天，各组游泳路程比较，差异有统计学意义（F=3.128，P=0.032）。与Tg-con组比较，Tg-iso组游泳路程缩短（P=0.027）。见图4。

目标象限时间百分比和路程百分比各组间差异无统计学意义（P=0.392和0.300）。见图5。

2.3 Y迷宫结果

图1 鼠尾PCR检测电泳图

图2 Morris水迷宫实验中各组小鼠运动能力的比较

图3 定位航行实验中各组小鼠潜伏期的比较

图4 定位航行实验中各组小鼠游泳路程的比较

图5 空间探索实验中各组小鼠目标象限时间、路程百分比的比较

图6 Y迷宫实验中各组小鼠学习记忆能力的比较

如图6所示，各组辨别错误次数差异有统计学意义（F=3.247，P=0.046）。与Tg-con组比较，Wt-con组及Tg-iso组辨别错误次数明显减少（P=0.044和0.020）。

3 讨论

有实验采用的APPswe/PS1AE9双转基因小鼠可以模拟AD患者脑内β-淀粉样蛋白沉积所致的老年斑和tau蛋白磷酸化所致的神经纤维缠结等主要病理改变，而且随着月龄的增加其行为学方面也表现出不同程度的认知功能障碍[1-2]，为研究的实施提供很好的动物模型。

本实验选择小鼠7个月龄时行异氟醚麻醉，据报道此月龄的APPswe/PS1AE9双转基因小鼠尚未出现认知功能障碍[1]。而实验结果也证实Wt-con组与Tg-con组的潜伏期及游泳路程比较差异无统计学意义，说明此时APPswe/PS1AE9小鼠尚未产生认知功能障碍。在定位航行实验中，与Wt-con组比较，Wt-iso组的潜伏期及游泳路程缩短；与Tg-con组比较，Tg-iso组的潜伏期缩短。可见不论是APPswe/ PS1AE9小鼠还是野生对照型小鼠，异氟醚麻醉后在定位航行实验中的潜伏期均较自身对照组缩短，且野生型小鼠的游泳路程也明显较对照组缩短，表明重复异氟醚麻醉并未增加转基因型及野生型小鼠近期学习记忆功能障碍，与对照组比较其学习记忆能力在某种程度上反而有一定的提高。SU等[3]用C57小鼠行异氟醚重复麻醉（每天吸入1.4%异氟醚2 h，共5 d），48 h后行水迷宫实验，发现异氟醚麻醉后的小鼠学习能力明显增强，但麻醉后2周再次行水迷宫实验，两组比较差异无统计学意义。各组空间探索实验所测的时间与路程百分比没有区别，在定位航行实验中，不论是潜伏期还是游泳路程的比较，统计差异主要出现于前3天，这说明异氟醚可能主要影响学习的过程，一旦形成记忆后异氟醚的影响就变得不明显。SU等[3]的研究结果也显示空间探索实验中时间与路程百分比异氟醚组与对照组比较，差异无统计学意义。已有大量的临床及动物研究均证实异氟醚可增加老年患者认知功能障碍的风险，但本实验于小鼠中年时期进行异氟醚重复麻醉，而且近期的研究表明某些干预措施可以减轻异氟醚对这种认知功能的损伤[4-7]。LIU等[8]的研究发现3个月龄的C57小鼠吸入0.7%异氟醚0.5 h或2 h，其学习记忆的能力增强；吸入1.4%的异氟醚2 h，其学习记忆能力与对照组无差异；而吸入1.4%的异氟醚4 h，其学习记忆能力明显变弱。LEE[9]报道吸入2%异氟醚20～30 min可以改善缺氧引起的细胞损伤，而吸入2%异氟醚60 min或者吸入2.5%异氟醚20～30 min对缺氧引起的细胞损伤没有改善。PAN[10]的研究证实吸入0.5%异氟醚8 h可以减轻Caspase-3和H4人类神经胶质细胞天冬氨酰蛋白酶β位点裂解酶的含量，而吸入2%异氟醚8 h可以增加以上2种物质的含量。可见长时间高浓度地吸入异氟醚是导致学习记忆能力减退及细胞损伤的重要原因。该研究的结果表明重复吸入异氟醚麻醉不增加术后认知功能障碍的风险，可能与吸入异氟醚的浓度及时间有关。1.1%异氟醚麻醉2 h，浓度低，时间短，对于APP-swe/PS1AE9及野生对照小鼠的近期认知功能均无损伤，反而在一定程度上有促进的作用。

为了观察异氟醚重复麻醉对APPswe/PS1AE9及野生对照小鼠认知功能的远期影响，于小鼠12个月龄时进行了Y迷宫实验。结果表明与Wt-con组比较，Tg-con组辨别错误次数明显增加，说明此时APPswe/PS1AE9小鼠已形成认知功能障碍。MINKE VICIENE[1]的研究表明APPswe/PS1AE9小鼠在10个月时表现出轻度的认知功能损坏，至15个月时其认知功能损坏表现得非常显著。Wt-con组与Wt-iso组辨别错误次数差异无统计学意义，而Tg-con组较Tg-iso组辨别错误次数增加，说明异氟醚延缓APP swe/PS1AE9小鼠认知功能障碍的发生，但异氟醚所起的作用及持续时间不得而知，可能是Wt-con组与Wt-iso组差异无统计学意义的原因。关于引起本实验结果的机制还有待进一步研究。近期XIONG等[11]的研究显示长期的跑台实验可以改善APPswe/PS1dE9小鼠在水迷宫的空间记忆，可能与脑源性神经营养因子含量增加同时激活的小胶质细胞减少有关，但与APPswe/PS1dE9小鼠脑内β-淀粉样蛋白含量无相关性。TANIUCHI等[12]的研究认为APPswe/ PS1dE9小鼠9个月的时候表现出认知功能障碍，而此时正是β-淀粉样蛋白大量堆积的时候，ORRE[13]同时证实是β-淀粉样蛋白激活脑内神经胶质细胞的活性，所以β-淀粉样蛋白可能是导致APP swe/PS1dE9小鼠认知功能损伤的原因。而且IZCO[14]的研究表明伴随APPswe/PS1dE9小鼠月龄增加，其脑内不可溶性β-淀粉样蛋白逐渐增加，血液内不可溶性β-淀粉样蛋白逐渐减少，同时其学习能力也逐渐下降，两者有相关性。LAURSEN[15]的研究进一步证明APPswe/PS1dE9小鼠脑室内注射乙酰胆碱免疫毒素后其认知功能减退，且脑组织内斑块堆积增加，脑内β-淀粉样蛋白含量也增加，认为胆碱能系统功能减退可促进认知功能损伤。关于本实验上述结论的机制有待进一步深入研究。

综上所述，短时间重复吸入低浓度的异氟醚不增加阿尔茨海默病APPswe/PS1dE9双转基因型小鼠及野生对照小鼠近期及远期学习记忆能力障碍的风险，反而在一定程度上有减轻的作用。其机制还有待进一步研究。本研究结果为临床上对AD患者及普通患者麻醉的实施提供了参考依据，可在一定程度上避免术后认知功能障碍的发生。

参考文献：

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[2]SAVONENKO A,XU G M,MELNIKOVA T,et al.Episodic-like memory deficits in the APPswe/PS1dE9 mouse model of Alzheimer's disease:relationships to Aβ-amyloid deposition and neurotransmitter abnormalities[J].Neurobiol Dis,2005,18(3):602-617.

[3]SU D,ZHAO Y,WANG B,et al.Repeated but not single isoflurane exposure improved the spatial memory of young adult mice[J].Acta anaesthesiologica Scandinavica,2011,55(4):468-473.

[4]KONG F,CHEN S,CHENG Y,et al.Minocycline attenuates cognitive impairment induced by isoflurane anesthesia in aged rats[J].PLoS One,2013,8(4):DOI:10.1371/journal.pone.0061385.

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[7]JIA M,LIU W X,SUN H L,et al.Suberoylanilide hydroxamic acid,a histone deacetylase inhibitor,attenuates postoperative cognitive dysfunction in aging mice[J].Front Mol Neurosci,2015,9(23): 8-52.

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[9]LEE J J,LI L,JUNG H H,et al.Postconditioning with isoflurane reduced ischemia-induced brain injury in rats[J].Anesthesiology, 2008,108(6):1055-1062.

[10]PAN C,XU Z,DONG Y,et al.The potential dual effects of anesthetic isoflurane on hypoxia-Induced caspase-3 activation and increases in {beta}-site amyloid precursor protein-Cleaving enzyme levels[J].Anesth Analg,2011,113(1):145-152.

[11]XIONG J Y,LI S C,SUN Y X,et al.Long-term treadmill exercise improves spatial memory of male APPswe/PS1dE9 mice by regulation of BDNF expression and microglia activation[J]. Biol Sport,2015,32(4):295-300.

[12]TANIUCHI N,NIIDOME T,SUGIMOTO H.Fundamental study of memory impairment and non-cognitive behavioral alterations in APPswe/PS1dE9 mice[J].Yakugaku Zasshi,2015,135(2): 323-329.

[13]ORRE M,KAMPHUIS W,DOOVES S,et al.Reactive glia show increased immunoproteasome activity in Alzheimer's disease[J].Brain,2013,136(5):1415-1431.

[14]IZCO M,MARTINEZ P,CCRRALES A,et al.Changes in the brain and plasma Aβ peptide levels with age and its relationship with cognitive impairment intheAPPswe/PS1dE9 mouse model of Alzheimer's disease[J].Neuroscience,2014,28(3):269-279.

[15]LAURSEN B,MORK A,PLATH N,et al.Cholinergic degeneration is associated with increased plaque deposition and cognitive impairment in APPswe/PS1dE9 mice[J].Behav Brain Res, 2013,240(1):146-152.

（张蕾 编辑）

Influences of Isoflurane on learning and memory of APPswe/ PS1AE9 double transgenic mice of Alzheimer disease*

Yan-xing Zhao1,Dian-san Su2,Jie Chen2,Xiang-rui Wang2
(1.Department of Anesthesiology,Guang'anmen Hospital,China Academy of Chinese Medical Science,Beijing 100053,China;2.Department of Anesthesiology,Renji Hospital Affiliated to Medical School of Shanghai Jiao Tong University,Shanghai 200127,China)

Objective To study the influences of Isoflurane on learning and memory of APPswe/PS1AE9 double transgenic mice of Alzheimer disease(AD).Methods Transgenic mice were divided into Tg-iso group and Tg-con group,wild-type mice were divided into Wt-iso group and Wt-con group.At the age of seven months,the Tg-iso group and the Wt-iso group were exposed to 1.1%Isoflurane for 2 hours per day for 5 days.Meanwhile,the mice in the Tg-con group and the Wt-con group inhaled oxygen/nitrogen (FiO2=30%).Learning and memory abilities were tested 48 hours and 5 months after Isoflurane exposure using the Morris Water Maze and Y maze,respectively. Results At the age of seven months,mean latency in the Wt-iso group decreased in a place navigation test compared to the Wt-con group(P=0.013);compared to the Tg-con group,the mean latency decreased in the Tgiso group(P=0.043);there was no significant statistical difference in the target quadrant time or distance percentage in probe trials among the groups(P=0.392).At the age of twelve months,compared to the Tg-con group,the discrimination errors of the Wt-con and Tg-iso groups decreased(P=0.044 and 0.020).Conclusions Repeatedlow-dose Isoflurane anaesthesia does not increase the dysfunction of learning and memory of APPswe/PS1AE9 double transgenic mice and wild type mice,to some extent,can even decrease dysfunction of learning and memory in APPswe/PS1AE9 double transgenic mice and wild type mice.

learning and memory;Isoflurane;APPswe/PS1AE9 double transgenic mice;Y-maze;Morris water maze

R-332

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.04.001

1005-8982（2017）04-0001-06

2016-09-05

国家自然科学基金（No：30801069）；上海市自然科学基金（No：08ZR1413700）；教育部博士点基金（No：200802481094）；上海市科技启明星项目（No：09QA1403800）

苏殿三，E-mail：diansansu@yahoo.corn