陈亚勇，郭晨明，迪丽米娜·伊拉木，付明刚，吴 楠，郭丽英

MicroRNA-10b与早期乳腺浸润性导管癌的临床及预后研究*

陈亚勇，郭晨明，迪丽米娜·伊拉木，付明刚，吴 楠，郭丽英

（新疆医科大学第一附属医院 乳腺外科，新疆 乌鲁木齐830054）

目的 探讨早期乳腺浸润性导管癌中microRNA-10b（miR-10b）表达与临床指标及预后关系。 方法 采用原位分子杂交技术，检测305例中早期乳腺浸润性导管癌组织miR-10b表达，采用Pearsonχ2检验分析miR-10b表达在不同临床指标间的差异性；采用Spearman秩和相关分析早期乳腺浸润性导管癌中miR-10b、年龄、淋巴结、雌激素受体α（ERα）、孕激素受体（PR）及人类表皮生长因子受体2（HER-2）之间的相关性。采用Kaplan-Meier法计算累计无瘤生存时间，应用Log-rank检验比较miR-10b不同表达组间无瘤生存时间的差异。结果 早期乳腺浸润性导管癌中miR-10b表达与年龄、肿瘤大小和复发转移，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与月经状态、临床分期、化疗、放疗及内分泌治疗比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。miR-10b阳性表达与HER-2阳性表达呈正相关，差异有统计学意义（P＜0.05）。miR-10b表达阴性中位无瘤生存时间较miR-10b表达阳性时间长，两者比较差异有统计学意义（P＜0.05）；淋巴结阴性时miR-10b阴性表达的中位无瘤生存时间较阳性表达长，两者比较差异有统计学意义（P＜0.05）；相反，miR-10b表达在淋巴结阳性中位无瘤生存时间无统计学意义（P＞0.05）。结论 miR-10b表达水平与早期乳腺浸润性导管癌复发转移相关，特别在无淋巴结转移且miR-10b阳性表达组的中位无瘤生存时间短，预后差。miR-10b阳性表达是早期乳腺浸润性导管癌的预后因素。

早期乳腺浸润性导管癌；microRNA-10b；临床；预后

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率占女性恶性肿瘤第1位，每年全球约有50万女性死于乳腺癌[1-2]。浸润性导管癌为乳腺癌常见的病理类型，约占乳腺癌的75%，而乳腺癌死亡原因是复发转移，早期乳腺浸润性导管癌为其类型之一，有一部分患者在早期即可出现复发转移而导致死亡。近年来，研究早期乳腺浸润性导管癌倍受关注。MicroRNA（miRNA）是近年来新发现的一类小分子RNA，microRNA-10b（miR-10b）作为其家族中的一员，定位于人2号染色体短臂3区1带1亚带的HOXD4与HOXD8基因之间，具有3'帽子和5'多聚尾的初始转录结构。研究表明miR-10b在乳腺癌和其他癌症组织中均存在异常表达，它调控乳腺癌细胞生长增殖与凋亡[3]。miR-10b也参与乳腺癌转移的平衡机制，能够使非转移性乳腺癌肿瘤细胞获得浸润和转移能力[4-6]。以上研究表明miR-10b高表达与乳腺癌及非转移性乳腺癌的复发转移存在一定的相关性。目前，尚无miR-10b与早期乳腺浸润性导管癌复发转移及预后相关研究。本研究采用原位杂交法，检测305例早期乳腺浸润性导管癌组织中miR-10b表达情况，分析miR-10b表达与早期乳腺浸润性导管癌临床指标及预后关系，探讨miR-10b是否与其复发转移相关，其能否作为临床预后的指标。

1 资料与方法

1.1 标本来源

本研究资料来源为自2000年1月-2013年12月在新疆医科大学第一附属医院乳腺外科收治且临床资料及随访信息完整，并经病理证实的乳腺癌患者约2 600例。对数据库内患者进行长期随访，随访间隔为1年，术后随访2～15年，随访截止时间为2015年12月31日，随访方式为门诊、住院复诊以及电话回访。随访期间未发现复发转移者认为无瘤生存，通过超声和影像学检查等发现转移病灶和/或病理证实转移者明确为复发转移。本研究从上述数据库中排除新辅助化疗、放疗的患者，既往或现在患有其他肿瘤患者，由其他肿瘤引起的乳腺癌患者，纳入病理类型为乳腺浸润性导管癌且临床分期为0～Ⅱ期，手术方式为改良根治术，肿瘤大小≤3 cm，年龄为30～92岁，平均年龄43.8岁，临床早期患者共305例进行分析。

1.2 原位杂交染色

敏感性加强型原位杂交检测试剂盒I（POD）购自武汉博士德生物工程有限公司，探针（hsa-miR-10b）miRCURY LNA Detection ProbeDAB购自丹麦Exiqon公司。实验方法如下：①包埋组织切片，贴于APES载玻片上，70℃烤箱过夜，脱蜡脱水。②3%过氧化氢H2O2室温处理10 min，蒸馏水洗涤2次。胃蛋白酶（1 ml 3%柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀）37℃消化15 min。0.5 mol PBS洗3次，每次5 min，蒸馏水洗1次。③湿盒37℃预杂交3 h后添加地高辛标记的寡核苷酸探针，浓度2μg/ml。按每张切片加20μl杂交液。盖上原位杂交专用盖玻片，恒温箱37～40℃杂交过夜。④杂交后洗涤：去掉盖玻片，37～40℃2×SSC洗涤5 min×2；0.5×SSC洗涤15 min；0.2×SSC洗涤15 min。⑤滴加封闭液，37℃ 30 min后滴加生物素化鼠抗地高辛，室温120 min。0.5 mol PBS洗5 min，4次。⑥滴加SABC，室温30 min。0.5 mol PBS洗5 min，3次。⑦滴加生物素化过氧化物酶，室温30 min，0.5 mol PBS洗5min，4次。⑧DAB显色：1 ml蒸馏水加显色剂A、B、C各1滴，混匀，加至标本上。镜下显色，10～30 min，水洗终止显色。⑨苏木素复染，酒精逐级脱水，二甲苯透明，封片。

1.3 判断标准

以文献[1]为标准，阳性细胞的胞浆着色呈棕黄色。染色评分根据染色强度和阳性细胞数来评价：依照细胞阳性着色程度，无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。依照阳性细胞数量（5个高倍视野），阳性细胞总数1%～25%，1分；阳性细胞总数26%～50%，2分；阳性细胞总数51%～75%，3分；阳性细胞总数＞75%，4分。每例标本最后得分为阳性细胞数计分×染色强度计分之积，0分为（-），1～2分（+），3～4分（++），＞4分（+++）（见图1）。

图1 miR-10b表达情况

1.4 统计学方法

应用SPSS17.0统计软件包进行统计学处理。采用Pearson χ2检验分析miR-10b表达在不同临床指标间的差异性；采用Spearman秩和相关分析早期乳腺浸润性导管癌中miR-10b、年龄、淋巴结、雌激素受体α（estrogen receptor α，ERα）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）、人类表皮生长因子受体 2（human epidermal growth factor receptor 2，HER-2）之间的相关性。采用Kaplan-Meier法计算累计无瘤生存时间，应用 Log-rank检验比较miR-10b不同表达组间无瘤生存时间的差异。P＜0. 05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 早期乳腺浸润性导管癌miR-10b表达与临床指标的关系

分析305例早期乳腺浸润性导管癌miR-10b在不同临床指标中表达情况，结果显示：在年龄≥50岁、肿瘤直径2 cm＜T≤3 cm和复发转移中miR-10b阳性率高于年龄＜50岁、肿瘤T≤2 cm和无瘤生存组，差异具有统计学意义（χ2=7.832，P=0.05；χ2= 8.400，P=0.038；χ2=9.431，P=0.024）；miR-10b阳性表达率在月经状态、临床分期、化疗、放疗、内分泌治疗无统计学差异（P＞0.05），结果表明miR-10b阳性表达与早期乳腺浸润性导管癌在年龄、肿瘤大小和复发转移中存在相关性。见表1。

2.2 早期乳腺浸润性导管癌中miR-10b、年龄、淋巴结、ER-α、PR及HER-2之间的秩相关性分析

利用Spearman秩和相关分析305例早期乳腺浸润性导管癌患者组织中miR-10b、年龄、淋巴结、ER-α、PR及HER-2之间的相关性，结果表明：miR-10b与淋巴结、PR（+）、HER-2（-）呈正相关，其中miR-10b表达与HER-2（-）差异有统计学意义（P＜0.05），miR-10b表达与淋巴结、PR（+）不具有统计差异（P＞0.05）；年龄与miR-10b、淋巴结、PR（+）呈负相关，年龄与ER-α（+）、HER-2（-）呈正相关；淋巴结与ER-α（+）呈负相关，淋巴结与PR（+）、H ER-2（-）呈正相关；ER-α（+）与PR（+）、HER-2（-）呈正相关；PR（+）与HER-2（-）呈正相关，差异具有统计学意义（P＜0.05）；HER-2（-）与淋巴结、PR（+）差异具有统计学意义（P＜0.05）；结果表明：miR-10b阳性表达与HER-2阴性表达呈正相关。见表2。

2.3 早期乳腺浸润性导管癌miR-10b表达相关预后分析

2.3.1 早期乳腺浸润性导管癌miR-10b表达生存曲线比较 早期乳腺浸润性导管癌中miR-10b阳性表达和阴性表达进行无瘤生存时间Kaplan-Meier生存分析，结果显示：miR-10b（-）中位无瘤生存时间为11.863年，miR-10b阴性表达的中位无瘤生存时间高于其阳性表达的中位无瘤生存时间，9.940年miR-10b（+）、10.054年miR-10b（++）和9.084年miR-10b（+++），经Log-rank检验（χ2=8.805，P=0.032），差异有统计学意义。见图2。

表1 miR-10b表达与临床指标的关系 例（%）

2.3.2 早期乳腺浸润性导管癌淋巴结阴性与miR-10b表达生存曲线比较 早期乳腺浸润性导管癌当淋巴结阴性时进行Kaplan-Meier生存分析，结果提示：miR-10b（-）中位无瘤生存时间为12.282年，miR-10b阳性表达中位无瘤生存时间分别为：10.508年miR-10b（+）、8.624年miR-10b（++）和9.228年miR-10b（+++）低于miR-10b（-）表达的中位无瘤生存时间，经Log-rank检验（χ2=8.016，P= 0.046），差异有统计学意义。见图3。

表2 miR-10b与临床指标相关性

2.3.3 早期乳腺浸润性导管癌淋巴结阳性与miR-10b表达生存曲线比较 早期乳腺浸润性导管癌淋巴结阳性时进行Kaplan-Meier生存分析，结果提示：miR-10b（-）中位无瘤生存时间为11.426年，miR-10b阳性表达的中位无瘤生存时间分别为：7.118年miR-10b（+）、9.197年miR-10b（++）和8.421年miR-10b（+++），经Log-rank检验（χ2=3.605，P= 0.307），差异无统计学意义。见图4。

图2 miR-10b表达生存曲线比较

图3 miR-10b不同表达在淋巴结阴性生存曲线比较

图4 miR-10b不同表达在淋巴结阳性生存曲线比较

3 讨论

miRNA是通过调控大量的肿瘤基因在肿瘤侵袭与转移过程中的作用机制，最终导致肿瘤复发转移[8-11]；在乳腺癌中，不同miRNA表达与雌激素受体、孕激素受体或HER-2受体表达、淋巴结转移等生物学行为相关，成为乳腺癌分子学领域研究的热

点[12-14]。

据相关研究证明：miR-10b在转移的肿瘤细胞中有很高的表达，这是首个被发现的影响人类肿瘤细胞转移潜能的miRNA[15-17]。又有相关研究证明：miR-10b在无淋巴结转移组乳腺癌患者血清中表达下调，其在转移性乳腺癌细胞中表达明显升高且miR-10b的表达量与乳腺癌的恶性程度密切相关[18-21]。本研究结果提示miR-10b阳性表达与年龄、肿瘤大小和复发转移中差异具有统计学意义；miR-10b阳性表达率在不同月经状态、临床分期、有无化疗、有无放疗、有无内分泌治疗表达无统计学差异。表明miR-10b阳性表达与早期乳腺浸润性导管癌的侵袭性与其恶性程度密切相关，这与上述文献报道一致。

影响乳腺癌患者预后的因素很多，包括淋巴结状态、临床分期、肿瘤大小、激素受体状况、HER-2受体的扩增情况和年龄等[22-23]。在诸多影响乳腺癌患者预后的因素中，淋巴结转移是决定性因素之一。淋巴结在无转移者预后好，一旦出现转移，预后变差，而且随着转移数目的增加预后更差。本研究结果提示，在分析miR-10b表达与临床指标相关性时发现miR-10b与早起浸润性导管癌患者的HER-2状态差异具有统计学意义。表明miR-10b高表达与HER-2阳性表达呈正相关，即miR-10b阳性表达时HER-2表达含量明显增强，当HER-2过表达导致乳腺侵袭性及转移力增加，导致早期乳腺浸润性导管癌复发转移，预后差，认为miR-10b表达可能参与了早期复发转移阶段，以上说明miR-10b阳性表达是早期乳腺浸润性导管癌的复发转移因素，尽管它们之间的内在分子关系尚不清楚。

本文为进一步研究其是否与其复发转移相关，将305早期乳腺浸润性导管癌进行中位无瘤生存分析。结果表明：miR-10b阳性表达者中位无瘤生存时间下降，且miR-10b阴性表达的中位无瘤生存时间高于miR-10b阳性表达。当淋巴结阴性时，miR-10b阴性表达的中位无瘤生存时间高于阳性；相反，当淋巴结阳性时，miR-10b生存分析显示差异无统计学意义。提示miR-10b阳性表达可能导致或者参与了早期乳腺浸润性导管癌发生复发转移，特别在无淋巴结转移且miR-10b阳性表达组的中位无瘤生存时间短，预后差。这与相关文献报道一致[4，13]。

综上所述，miR-10b与早期乳腺浸润性导管癌预后具有相关性，在早期乳腺浸润性导管癌侵袭转移过程中发挥重要作用，miR-10b阳性表达参与早期乳腺浸润性导管癌的复发转移，在有无淋巴结转移中具有差异性，特别在淋巴结阴性患者容易呈现复发转移。因此，miR-10b阳性表达为早期乳腺浸润性导管癌预后指标之一，miR-10b即可能作为早期乳腺浸润性导管癌发生预测的预测指标，也可能是一项临床预后指标。

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（张蕾 编辑）

Relationships of miR-10b expression with clinical parameters and prognosis in patients with early breast invasive ductal carcinoma*

Ya-yong Chen,Chen-ming Guo,Dilimina·Yilamu,Ming-gang Fu,Nan Wu,Li-ying Guo
(Department of Breast Cancer,the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi,Xinjiang 830054,China)

Objective To discuss the reationships of clinical parameters and prognosis of early breast invasive ductal carcinoma with miRNA-10b(miR-10b)expression.MethodsIn situmolecular hybridization technique was used to detect miR-10b expression in early breast invasive ductal cancer tissues of 305 cases.Pearson Chi-square test was adopted to analyze the differences in miR-10b expression between the patients with different clinical indicators.Spearman rank test was used to analyze the correlations of miR-10b expression with age,lymph node metastasis,estrogen receptor α(ERα),progesterone receptor(PR)and human epidermal growth factor receptor 2(HER-2) in early breast invasive ductal cancer.Kaplan-Meier method was adopted to calculate the accumulative tumor-free survival time.Log-rank test was applied to compare the tumor-free survival time between the groups with different miR-10b expressions.Results There were significant differences in age,tumor recurrence and metastasis betweenthe early breast invasive ductal cancer patients with different miR-10b expressions(P＜0.05);however,there was no significant difference in menstrual status,clinical stage,chemotherapy,radiotherapy or endocrine therapy(P＞0.05). Positive miR-10b expression was positively correlated with positive HER-2 expression(P＜0.05).The median survival time of the patients with negative miR-10b expression was significantly longer than that of the patients with positive miR-10b expression(P＜0.05).When there was no lymph node metastasis,the median tumor-free survival time of the patients with negative miR-10b expression was significantly longer than that of the patients with positive miR-10b expression(P＜0.05);while there was no statistical difference in the median tumor-free survival time when there was lymph node metastasis(P＞0.05).Conclusions miR-10b expression level is associated with recurrence and metastasis of early breast invasive ductal carcinoma,especially in the absence of lymph node metastasis;and in the miR-10b positive expression group the median tumor-free survival time is short,the prognosis is poor.miR-10b positive expression is a prognostic factor of early breast invasive ductal cancer.

early breast invasive ductal carcinoma;miR-10b;clinic;prognosis

R737.9

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.04.008

1005-8982（2017）04-0040-06

2016-08-02

新疆重大疾病医学重点实验室专项（No：SKLI-XJMDR-ZX-2014-1）

郭丽英，E-mail：ggs318@126.com