李 晖，姬荣伟

进展期胃癌中神经旁浸润与HER-2表达及其相关性分析

李 晖1，姬荣伟2

目的 检测进展期胃癌中神经旁浸润(perineural invasion, PNI)的发生及人表皮生长因子受体2(human epidermalgrowth factor receptor-2, HER-2)的表达，分析两者对进展期胃癌预后的影响以及两者之间的相关性。方法 采用HE染色对100例进展期胃癌组织进行PNI阳性筛选并运用免疫组化法检测HER-2的表达，分析PNI与HER-2表达和进展期胃癌临床病理特征的关系及两者之间的相关性。结果 PNI阳性者共42例，阳性率为42%，PNI的发生与淋巴结转移、浸润深度、癌栓、TNM分期及HER-2表达等因素具有一定的相关性，差异有统计学意义(P<0.05)。单因素生存分析显示，进展期胃癌的总生存率与T分期、癌栓、N分期、TNM分期、PNI和HER-2有关(P均<0.05)；PNI阳性患者生存期与PNI阴性患者相比明显降低，PNI阴性患者为45.3个月，PNI阳性患者为15.4个月(P<0.05)。HER-2阳性患者平均生存期(22.7个月)与HER-2阴性患者(43.2个月)相比亦明显降低(P<0.05)。多因素生存分析显示PNI和HER-2表达均对患者总生存率具有影响，是影响预后的独立危险因素(P均<0.05)。结论 进展期胃癌术后检测PNI和HER-2对患者预后具有一定的提示作用，HER-2原癌基因蛋白可能与PNI的发生具有一定关联性或发挥一定的协同作用。

胃肿瘤；进展期胃癌；神经旁浸润；HER-2；相关性；预后

胃癌在我国各种恶性肿瘤排行中趋于首位。恶性肿瘤分为不同的类型，按其病情发展的程度可分为早期胃癌和进展期胃癌[1]。由于胃癌早期症状不明显，多数患者就诊时已发展到中晚期，即进展期。进展期胃癌是指癌组织浸润已超过黏膜下层而达到胃壁肌层、浆膜层以及浆膜外，此时病灶直径多>2 cm，临床预后效果较差，总体5年生存率≤20%，因此探索新的病理学指标对进展期胃癌预后进行判断具有十分重要的意义。近年来的研究表明，人表皮生长因子受体2(HER-2)作为表皮生长因子受体家族中的一员，在许多实体肿瘤中存在高表达或异常表达，例如肾癌、乳腺癌、肺癌、胶质细胞等，这些异常表达往往影响着恶性肿瘤的演进过程[2]。有关研究人员指出对胃癌HER-2状态进行病理学诊断，有助于判断胃癌患者是否需要抗HER-2治疗，对肿瘤预后具有提示作用，可提高HER-2阳性胃癌患者的生存率。另一方面，神经旁浸润(perineuralinvasion, PNI)已被证实对某些癌症的预后有重要影响，如PNI可促进胆道癌和胰腺癌的局部扩散。近几年研究学者[3]逐渐开始关注PNI对于胃癌预后的影响，并得出了一些初步结论，而关于进展期胃癌PNI与HER-2表达对于预后的影响及两者相关性的研究还相对较少。本文采用免疫组化法检测HER-2在伴有PNI的胃癌组织中的表达，探讨PNI与HER-2之间是否存在相关性，为进行期胃癌的诊断、治疗和预后提供依据。

1 材料与方法

1.1 临床资料 收集郑州市三甲医院100例胃癌样本，每例样本均有完整随访资料，且所有病例均为进展期胃癌。其中男性56例，女性44例，年龄39～76岁，平均年龄54岁。样本包括胃体癌49例，贲门胃底癌21例，胃底癌30例。依据1998年《恶性肿瘤TNM分类法》对100例进展期胃癌样本进行TNM分期：I期11例，Ⅱ期29例，Ⅲ期55例，Ⅳ期5例。按肿瘤分化程度进行分类：高分化21例，中分化47例，低分化32例。

1.2 PNI筛选方法 用10%中性福尔马林固定100例样本的病理组织24～48 h，进行石蜡包埋，连续4 μm厚切片，随后进行HE染色。PNI呈阳性的判定标准为在光镜下检查发现癌细胞侵入肿瘤组织内神经束膜或神经束。

1.3 免疫组化及HER-2判读标准 运用免疫组化法检测胃癌组织中HER-2表达，将组织进行常规脱蜡、水洗后高温高压修复，采用MaxVision两步法染色，滴加新鲜配置的DAB溶液显色1～2 min，苏木精衬染、脱水、透明、中性树胶封固。PBS代替一抗作为阴性对照。

进行期胃癌组织中HER-2蛋白的表达依据文献进行如下计分标准判定。肿瘤细胞中无反应或者细胞膜阳性细胞比例<10%记为0；部分细胞膜阳性细胞比例≥10%且反应强度为弱反应记为1+；肿瘤细胞中完全或者部分细胞膜阳性细胞比例≥10%且反应强度为弱至中等反应记为2+；肿瘤细胞中完全或者部分细胞膜阳性细胞比例≥10%且反应强度为强反应记为3+。本组实验将0或1+定义为HER-2阴性，3+或2+定义为HER-2阳性。

1.4 随访 采用电话询问方式进行随访，随访时间总长为60个月，最短为3个月。患者预后评价指标为总生存率，其定义是确诊为进行期胃癌至最后一次随访时间或由肿瘤原因引起死亡时间的患者数占总患者数的百分比。

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0软件和Matlab软件作为所得数据统计学分析手段。将性别、年龄、分化程度、浸润深度、癌栓、淋巴结转移、TNM分期及HER-2表达信息纳入统计模型。选择χ2检验对分类数据进行假设检验，P<0.05为差异有统计学意义。采用Kaplan-Meier法分析生存率并绘制生存曲线，并用Log-rank检验进行生存曲线比较。最后采用Cox比例风险回归模型分析进展期胃癌预后的独立危险因素。

2 结果

2.1 PNI与进展期胃癌临床病理特征的关系 本组100例进展期胃癌患者中PNI阳性者共42例，占总患者人数的42%(图1)。统计分析发现患者性别、年龄以及分化程度与进展期胃癌中PNI的发生无明显相关性；淋巴结转移、浸润深度、癌栓、TNM分期及HER-2表达与PNI的发生具有明显相关性，差异有统计学意义(P<0.05，表1)。

2.2 PNI与HER-2表达的相关性 实验结果显示PNI阳性者中HER-2表达高于PNI阴性者(图2)；经Matlab软件中的ANN神经网络模型相关性检验显示，PNI和HER-2的表达呈正相关(图3)。

图1 A.进展期胃癌中PNI呈阳性，肿瘤细胞侵及神经束；B.进展期胃癌中PNI呈阳性，肿瘤细胞侵及神经束膜

表1 PNI与进展期胃癌临床病例指标的关系

2.3 PNI、HER-2与进展期胃癌患者的预后分析 对100例进展期胃癌患者数据进行生存分析，分别以PNI和HER-2表达绘制生存曲线(图4、5)。统计结果显示：PNI阴性者平均生存期为45.3个月，PNI阳性者为15.4个月(χ2=18.645，P<0.01)，平均生存期明显低于PNI阴性患者；HER-2阴性者的平均生存期为43.2个月，HER-2阳性者为22.7个月(χ2=14.193，P<0.01)，平均生存期明显低于HER-2阴性患者。单因素生存分析显示PNI和HER-2表达阳性患者平均生存率均明显低于阴性患者。将PNI和HER-2表达纳入多因素Cox回归分析模型，分析结果显示PNI和HER-2表达与其它因素(TNM分期、癌栓等)同样可作为独立危险因素对患者总生存率造成重要影响(表2)。

图2 A.进展期胃癌中HER-2呈阳性；B.进展期胃癌中HER-2呈阴性，MaxVision两步法

图3 进展期胃癌PNI与HER-2表达拟合曲线

图4 PNI阳性与PNI阴性进展期胃癌患者生存曲线的比较

图5 HER-2阳性与HER-2阴性进展期胃癌患者生存曲线的比较

表2 进展期胃癌患者总生存率预后影响因素分析

HR：hazard ratio(风险比)

3 讨论

随着周围神经浸润的研究不断深入，人们对于PNI已有一定的了解，普遍认同胃癌中PNI阳性率随肿瘤的进展而增加，但对PNI的阳性率存在一定的差异，这可能与不同研究对于PNI的定义不同有关。目前关于PNI的定义有两种表述，一种表述认为肿瘤细胞侵入神经束膜或神经束即可视为肿瘤PNI；另一种表述认为肿瘤细胞侵入神经鞘或位于神经周围且使33%以上的神经周径受累方可认定为PNI[4]。本组实验采用PNI的广泛定义得出PNI阳性率为42%，经统计学分析得出结论显示PNI与淋巴结转移、浸润深度、癌栓、TNM分期及HER-2表达有显著相关性，而与患者性别、年龄以及分化程度无明显相关性。PNI指标在提示癌症预后信息问题上尚未得到统一认识，一些研究认为[5]，虽然胃癌患者手术后存活状态与PNI有一定关系，但PNI是胃癌独立预后因素这一结论不能由此推出。而越来越多的研究倾向于进展期胃癌的预后判断标准之一即为胃癌患者PNI是否呈阳性[6-9]。本研究为PNI可作为进展期胃癌患者独立预后因素进一步提供了依据。

HER-2基因扩增的产物可影响肿瘤细胞的生物活性，调节肿瘤细胞的增殖、凋亡、黏附、分化以及浸润等，为肿瘤重要的生物标志物之一。在不同的研究报道[10-12]中进展期胃癌HER-2表达的阳性率不尽相同，主要原因可能是与胃癌肿瘤异质性较高以及不同研究的患者种族差异、样本量差异、检测方法差异和评分标准差异相关。HER-2促进肿瘤细胞不断分裂增殖的原因是HER-2本身的酪氨酸激酶活性结合表皮生长因子(EGF)后启动了其基因扩增程序。相关研究表明:胃癌、乳腺癌、膀胱癌和头颈部鳞癌的HER-2表达均有所增高。HER-2阳性胃癌患者癌细胞增长较快，侵袭性很强，这类患者病情也相对更容易恶化[13]。我国对HER-2检测的认知度普遍较低，HER-2检测率尚不足20%，导致不少HER-2阳性胃癌患者错失治疗良机。近年来相关研究显示，HER-2表达可能与胃癌的一些重要临床病理特征有关。Kim等[14]的研究表明有淋巴结转移、分化程度高者HER-2阳性率高，该研究通过对1 414例胃癌组织中HER-2表达与患者预后的关系，发现HER-2阳性胃癌患者的预后较阴性者的预后差(P=0.014)，得出了HER-2与胃癌预后可能相关的结论。本组实验结果同样显示，HER-2阳性患者预后较HER-2阴性患者预后差(χ2=14.193，P<0.01)。本组实验通过将PNI和HER-2纳入多因素生存分析模型进行Cox回归分析，结果显示，PNI和HER-2表达同癌栓和TNM分期等因素一样，也是影响患者总生存率的独立危险因素，且PNI与HER-2的表达呈正相关，由此可以推测HER-2原癌基因蛋白可能通过某种方式协同促进肿瘤PNI的发生，后续可从分子水平上证实该推论并对其发生机制进行更加深入的研究。

综上所述，在多种因素共同作用下，肿瘤PNI的阳性率随着进展期胃癌病情的发展而升高。统计分析表明PNI阳性率和HER-2蛋白的表达可作为影响进展期胃癌患者生存率的独立危险因素，且两者表达呈正相关。因此，PNI可作为判断进展期胃癌患者预后的重要指标之一，HER-2蛋白的表达则可能是其作用机制的一部分。早期检测HER-2蛋白表达并在必要时进行重复活检有可能对即将发生的PNI起一定的预判作用，尽早发现、选择最正确、合适的治疗方案可能延长病患的生存时间，提高进展期胃癌患者的生存率。该推测需要进一步分析证实，为以后更加深入的研究提供理论依据。

[1] 陈苏蓉, 陈苏娟, 陈 平, 等. 多西他赛联合卡培他滨治疗老年进展期胃癌疗效观察[J].中国医药导刊, 2010,12(11):1925-1927.

[2] 夏红强, 何建蓉. Ki-67、EGFR、HER-2和p53在乳腺癌中的表达及其相关性[J]. 临床肿瘤学杂志, 2011,16(2):139-143.

[3] 张洪兰, 陈 昊, 张春芳, 等. 贲门胃底癌神经旁浸润与CIP2A表达及其预后意义[J]. 临床与实验病理学杂志, 2016,32(8):870-874.

[4] Yao J, Li W Y, Li S G,etal. Midkine promotes perineural invasion in human pancreatic cancer[J]. World J Gastroenterol, 2014,20(11):3018-3024.

[5] Yao J, Hu X F, Feng X S, Gao S G. Pleiotrophin promotes perineural invasion in pancreatic cancer[J]. World J Gastroenterol, 2013,19(39):6555-6558.

[6] Lv C Y, Zhou T, Chen W,etal. Preliminary study correlating CX3CL1/CX3CR1 expression with gastric carcinoma and gastric carcinoma perineural invasion[J]. World J Gastroenterol, 2014,20(15):4428-4432.

[7] 姚 军, 张伟丽. 神经侵犯与胃癌临床病理参数的关系及对胃癌预后的影响[J]. 中国实用神经疾病杂志, 2016,19(1):101-102.

[8] 高 杰, 邓为民. 胃癌局部神经侵犯的临床研究[J]. 中国中西医结合外科杂志, 2014,20(4):353-355.

[9] 王智民. 胃癌神经侵犯与胃癌预后的相关性分析[J]. 中国实用神经疾病杂志, 2016,19(2):57-59.

[10] 管慧红, 刘驯炎, 黄河澄, 等. 人表皮生长因子受体-2在食管鳞癌中的表达及其与预后的关系[J]. 广东医学, 2014,53(14):2260-2263.

[11] 王岳君, 王娜娜, 杨苗苗, 等. 胃癌中HER-2表达异质性的病理学分析[J]. 临床与实验病理学杂志, 2016,32(8):864-869.

[12] Abrahão-Machado L F, Jácome A A, Wohnrath D R,etal. HER-2 in gastric cancer: comparative analysis of three different antibodies using whole-tissue sections and tissue microarrays[J]. World J Gastroenterol, 2013,54(38):6438-6446.

[13] He C, Bian X Y, Ni X Z,etal. Correlation of human epidermal growth factor receptor 2 expression with clinicopathological characteristics and prognosis in gastric cancer[J]. World J Gastroenterol, 2013,19(14):2171-2178.

[14] Kim K C, Koh Y W, Chang H M,etal. Evaluation of HER2 protein expression in gastric carcinomas：comparative analysis of 1414 cases of whole-tissue sections and 595 cases of tissue microarrays[J] . Ann Surg Oncol, 2011, 18(10): 2833-2840.

Analysis of perineural invasion with HER-2 expression and its correlation in patients with advanced gastric cancer

LI Hui1, JI Rong-wei2

(1DepartmentofBasicMedicine,SiasInternationalUniversity,ZhengzhouUniversity,Xinzheng451150,China;2DepartmentofPathology,Xi’anXDGroupHospital,Xi’an710077,China)

Purpose To investigate the presence of perineural invasion(PNI) and the expression of human epidermal growth factor receptor 2 (HER-2) in patients with advanced gastric cancer.To discuss the correlation between PNI and the expression of HER-2 and their prognostic significance. Methods Paraffin sections of surgical specimens from 100 patients who underwent gastric resection were selected，and then PNI were detected by HE staining and the expression of HER-2 were detected by immunohistochemical (IHC). The correlation of perineural invasion with the clinicopathological features and HER-2 expression were performed. Results PNI was positive in 42 cases of 100 patients (PNI positive rate was 42%), the occurrence of PNI has significantly related with lymph node metastases, infiltrating depth,tumor emboli, TNM stage and expression of HER-2. The difference was statistically significant (P<0.05). Univariate analysis showed that total survival rate of advanced gastric cancer was associated with T stage, tumor emboli, N stage, TNM stage, PNI and HER-2 expression (P<0.05). The overall survival of the PNI-negative patients was 45.3 months on average,much better than the PNI positive patients who was 15.4 months in average (P<0.05). The overall survival of the HER-2-negative patients was 43.2 months on average,much better than the HER-2-positive patients who was 22.7 months in average (P<0.05). By muhivariable Cox proportional hazards model of overall survival, the positivity of PNI and HER-2 appeared to be new independent prognostic factors(P<0.05). Conclusion The detection of PNI and HER-2 expression maybe helpful for the prognosis of patients with advanced gastric cancer. In addition, HER-2 may be responsible for the presence of perineural invasion.

gastric neoplasms; advanced gastric cancer; perineural invasion; HER-2; correlation; prognosis

时间：2017-2-27 10:14

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170227.1014.032.html

1郑州大学西亚斯国际学院基础医学教研室，新郑 4511502西电集团医院病理科，西安 710077

李 晖，女，硕士，讲师。E-mail: liabcd1234567@163.com

R 735.2

A

1001-7399(2017)02-0178-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.02.014

接受日期：2016-12-05