姚 楠，孙景秋，张 琼

肝细胞癌中Dkk-3与Cyclin D1的表达及临床意义

姚 楠1，孙景秋2，张 琼1

目的 探讨Dkk-3与Cyclin D1蛋白在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)和癌旁组织中的表达，及两者表达与临床病理特征的相关性。方法 采用免疫组化法检测80例HCC及癌旁组织中Dkk-3和Cyclin D1蛋白的表达。结果 Dkk-3蛋白在HCC组织中的相对表达值低于癌旁组织(P<0.05)；Cyclin D1蛋白在HCC组织中的相对表达值高于癌旁组织(P<0.005)；Dkk-3和Cyclin D1蛋白相对表达值均与组织分化程度有关(P均<0.05)；HCC组织中Dkk-3与Cyclin D1蛋白表达呈负相关(P=0.044，rs=-0.226)。结论 Dkk-3蛋白可能通过影响Cyclin D1蛋白的表达影响HCC的发生、发展；联合检测Dkk-3和Cyclin D1蛋白表达可能对HCC的诊断及预后判断有一定参考价值。

肝肿瘤；Dkk-3；Cyclin D1；免疫组织化学

我国肝癌病死率位居癌症的第3位，仅次于肺癌和胃癌。因此研究其发病机制，对于判断其预后并指导治疗有重要意义。Dkk(Dickkopf)家族通过结合Wnt受体复合体低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(low density lipid receptor related protein 5/6, LRP5 /LRP6)来抑制Wnt信号通路[1]。其中Dkk-3位于人类染色体11p15.1的位点，相对分子质量为3.8×104，除了家族共有的结构外还包括一个扩充的N连接区域和C连接区域[2]。研究发现Dkk-3于成年啮齿类动物脑和成纤维细胞以及人肾上腺皮质中显著表达[3]，同时在人类多种肿瘤组织和细胞株中表达均减弱和消失，包括前列腺癌[4]、胃癌[5]、胰腺癌[6]、肺癌[7]、肾细胞癌[8]等。细胞周期蛋白D1是细胞周期素家族(Cyclin Ds)中与肿瘤关系最为密切的成员，其过度表达能引起细胞过度生长、转化及癌变。作为一种公认的癌基因，Cyclin D1已被证实在多种肿瘤细胞中呈过表达[9]。目前，关于肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)中Cyclin D1和Dkk-3蛋白表达之间关系的研究，国内外文献报道较少，本实验通过检测80例HCC标本中Cyclin D1和Dkk-3蛋白表达，分析两者之间的关系，并探讨两者与HCC发生、发展之间的关系。

1 材料与方法

1.1 临床资料 收集蚌埠医学院第一附属医院病理科2010年1月～2012年12月存档的HCC组织80例，其中男性60例，女性20例；年龄26～79岁，平均53岁。高分化18例，中分化36例，低分化26例；大肝癌63例，小肝癌17例。所有病例均经病理学证实为HCC，且术前均未行放、化疗。另收集癌旁组织40例，均为距肿瘤组织2 cm以上的正常肝组织。HCC组织及癌旁肝组织均取自手术标本。收集临床相关资料。

1.2 免疫组化 一抗多克隆兔抗人Dkk-3抗体购自上海联硕宝为生物公司，EliVision试剂盒及DAB显色试剂盒购自福州迈新公司。PAS染色液为蚌埠医学院第一附属医院病理科配制。组织采用10%中性福尔马林固定，石蜡包埋。4 μm厚切片，常规脱蜡、水化、3%H2O210 min阻断内源性过氧化物酶，高温高压修复10 min，按1 ∶100稀释度滴加Dkk-3抗体后，按试剂盒说明书进行免疫组化染色操作。DAB显色，苏木精复染。采用已知阳性片作为对照组，以PBS代替一抗作为空白对照组。

1.3 结果判定 Cyclin D1和Dkk-3蛋白均定位于细胞核，以染色呈棕黄色为阳性。采取二次计分法：每例标本随机选取10个高倍视野(×400)，计数每个高倍视野中阳性细胞所占百分比计分。(1)按染色强度评分：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。(2)按阳性细胞百分比计分：阴性为0分，阳性细胞数<10%为1分，11%～50%为2分，51%～75%为3分，≥76%为4分。将两项得分结果相乘：≤1分为阴性，>1分为阳性。免疫组化标记结果由两位病理医师采用独立双盲法判定。

1.4 统计学处理 采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，不同组间比较采用χ2检验及Spearman等级相关检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Dkk-3蛋白在HCC及癌旁组织中的表达 Dkk-3在HCC组织中的阳性率为26.3%(21/80)(图1、2)，而在癌旁组织中的阳性率为57.5%(23/40)，Dkk-3在HCC组织中的表达水平显著低于癌旁组织(P<0.05，表1)。

2.2 Cyclin D1在HCC及癌旁组织中的表达 Cyclin D1在HCC组织中的阳性率为47.5%(38/80)(图3)，而癌旁组织中的阳性率较低，仅为22.5%(9/40)，组间相比差异有显著性(P<0.05，表1)。

图1 Dkk⁃3在高分化HCC中的表达，EliVison法图2 Dkk⁃3在低分化HCC中的表达，EliVison法图3 CyclinD1在HCC中的表达，EliVison法

表1 Dkk-3和Cyclin D1在HCC及癌旁组织中的表达

2.3 HCC中Dkk-3、Cyclin D1表达的相关性 Dkk-3和Cyclin D1蛋白表达均与组织分化程度有关(P均<0.05)；与患者性别、年龄及肿瘤大小无关(表2)。对两者阳性表达强度之间的相关性比较得出，Dkk-3和Cyclin D1蛋白在HCC组织中的表达呈负相关(P=0.044，rs=-0.226，表3)。

表2 Dkk-3和Cyclin D1表达与HCC临床病理特征的关系

表3 HCC中Dkk-3、Cyclin D1表达的相关性

3 讨论

HCC是常见的消化系统恶性肿瘤，其发生、发展是多步骤、多基因突变的过程。经典的Wnt/β-catenin信号通路的异常持续激活被认为与许多恶性肿瘤的发生、发展有关，其中包括HCC[10]。

有研究者认为，Dkk-3蛋白作为一个抑癌基因，可能通过下调β-catenin实现对Wnt通路的抑制作用[11]，从而起到抑制肿瘤发生、发展的作用。Dkk-3表达下调可能与启动子的甲基化有关。在多种肿瘤细胞株中Dkk-3表达均明显降低，实验证实，经腺病毒载体转染Dkk-3基因使其在肿瘤细胞高表达后可诱导肿瘤细胞的凋亡[12]。但其与肝癌的关系并未深入研究，国内仅见个别报道，且在蛋白表达水平上存在差异。基于此，本组实验通过免疫组化对比HCC及正常肝组织中Dkk-3蛋白表达差异及其与临床病理特征之间的关系，了解其与HCC发生、发展之间的关系。结合国内外文献报道与本组实验结果，不难推测，Dkk-3与原发性肝癌的发病机制有着密切的关系。同时作者推测，通过促进癌细胞Dkk-3的表达，抑制Wnt通路的异常活化有望成为治疗肿瘤的一条新途径。

Cyclin D1蛋白是Wnt通路上重要的调节蛋白，可以在G1期激活周期素依懒性激酶CDK4的活性，促进细胞进入S期。因此，其过表达可以使细胞缩短由G1期进入S期的时间，使细胞快速增殖从而形成肿瘤，被认为是与肿瘤发生有密切关联的癌基因[13]。本组实验中Cyclin D1蛋白表达在HCC组织中明显升高，在HCC和癌旁组织中的表达差异有统计学意义，说明Cyclin D1蛋白表达上调与HCC的发生密切相关。Cyclin D1蛋白表达与患者年龄、肿瘤大小、临床分期无关。Cyclin D1是Wnt通路中的核心环节[14]。本实验在对Dkk-3蛋白和Cyclin D1在HCC组织中表达的免疫组化检测结果进行的相关性分析中，发现两者蛋白表达呈负相关，即随着Cyclin D1蛋白表达的升高，HCC组织中的Dkk-3蛋白表达持续降低。

综上所述，作者认为在HCC发生、发展过程中，Cyclin D1蛋白和Dkk-3蛋白共同作用在Wnt通路上，Dkk-3通过抑制Dsh蛋白的活化对Wnt信号转导通路起抑制作用[15]，而β-catenin与Cyclin D1促进子序列结合，可增加Cyclin D1的转录。作者推测Cyclin D1蛋白和Dkk-3蛋白在Wnt通路中为上下游关系，且两者可能起到拮抗作用。因此，联合检测HCC中Cyclin D1蛋白和Dkk-3蛋白表达，将有助于评估HCC的恶性程度及患者预后。

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Expression of Dkk-3 and Cyclin D1 protein in hepatocellular carcinoma and their clinical significance

YAO Nan1, SUN Jing-qiu2, ZHANG Qiong1

(1DepartmentofPathology,2DepartmentofNuclearMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege,Bengbu233003,China)

Purpose To investigate the expression of Dkk-3 and Cyclin D1 protein in human hepatocellular carcinoma(HCC) and clinical significance. Methods Immunohistochemistry was used to detect Dkk-3 and Cyclin D1 protein expression level in 80 cases of hepatocellular carcinoma and corresponding para-cancer tissue. Results The expression of Dkk-3 in hepatocellular carcinoma was significantly lower than those in corresponding para-cancer tissue (P<0.05) and the expression of Cyclin D1 in hepatocellular carcinoma was significantly higher than those in corresponding para-cancer tissue (P<0.05). The up-regulation of Cyclin D1 and the down-regulation of Dkk-3 proteins were correlated with pathologic differentiation degree (P<0.05). There was a significant inverse correlation between Dkk-3 and Cyclin D1 expression (P=0.044,rs=-0.226). Conclusion The abnormal expression of Dkk-3 and Cyclin D1 gene in human hepatocellular carcinoma suggest that Dkk-3 and Cyclin D1 gene may play an important role in the development and progression of the cancer. The combination detection of the two biomarkers may provide valuable data for diagnosis and prognosis estimation of HCC.

hepatocellular neoplasms; Dkk-3; Cyclin D1; immunohistochemistry

时间：2017-2-27 10:14

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170227.1014.020.html

蚌埠医学院校级课题基金(Byky1316)

安徽省蚌埠医学院第一附属医院1病理科、2核医学科， 蚌埠 233003

姚 楠，女，讲师。E-mail: yaonan1979@126.com

R 735.7

A

1001-7399(2017)02-0158-04

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.02.009

接受日期：2016-11-22