罗 伟，朱小年，谭盛葵,

·论 著·

胰腺癌中PcG相关蛋白RYBP的表达及临床意义

罗 伟1，朱小年2，谭盛葵1,2

目的 探讨PcG相关蛋白RYBP在胰腺癌中的表达及其临床意义。方法 采用免疫组化法检测51例胰腺癌及对应癌旁组织中RYBP的表达，分析其表达与胰腺癌临床病理特征的关系。Kaplan-Meier法分析RYBP表达与胰腺癌患者术后生存时间的关系。结果 RYBP在胰腺癌中的阳性率(31.4%，16/51)明显低于癌旁组织(66.7%，34/51)，两者差异有统计学意义(P<0.05)。RYBP表达与患者性别、年龄、吸烟、饮酒、肿瘤数目、有无淋巴结转移和血清CA199水平无明显相关性(P>0.05)，与肿瘤直径及肿瘤病理分级有相关性(P<0.05)。Kaplan-Meier法分析显示RYBP阳性组患者的总生存率明显高于阴性组(P<0.05)。结论 PcG相关蛋白RYBP在胰腺癌中低表达，RYBP表达降低可能与胰腺癌发生、发展密切相关。

胰腺肿瘤；RYBP；细胞凋亡

PcG蛋白是一类在转录过程发挥表观遗传调控作用的蛋白，广泛参与细胞生长、发育、增殖、分化以及肿瘤发生等重要过程。RYBP作为PcG蛋白家族成员，参与多梳蛋白抑制复合物(PRC1)的组成，在个体发育、抑制基因转录、细胞凋亡以及调控表观遗传等方面发挥重要作用[1-2]。近年研究表明，RYBP与人类恶性肿瘤的发生、发展密切相关。目前有关RYBP与胰腺癌的关系尚未见报道，本文应用免疫组化法检测RYBP在胰腺癌和癌旁组织中的表达，分析其表达与胰腺癌临床病理特征及预后的关系，为寻找胰腺癌早期诊断及判断预后的分子标志物及分子靶向治疗的有效靶点提供参考。

1 材料与方法

1.1 临床资料 收集桂林医学院附属医院病理科2007～2013年存档的配对胰腺癌及癌旁组织石蜡标本51例，临床和病理诊断均为胰腺癌，选取的癌旁组织距癌灶距离>2 cm。所有患者均在本院行手术治疗，术前均未行放、化疗，且有完整的临床资料。所有标本获取均征得患者及家属同意，并通过医院伦理委员会批准。

1.2 免疫组化 将收集的蜡块4 μm厚切片，采用免疫组化SP两步法检测RYBP的表达，具体步骤如下：切片经60 ℃烤片1 h后经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，置于EDTA缓冲液(pH 8.0)中高压加热抗原修复3 min，浸泡于3%过氧化氢溶液15 min去除内源性过氧化酶，马血清室温封闭30 min，滴加RYBP一抗(购于美国Proteintech公司，工作浓度1 ∶100)，37 ℃温箱孵育1 h，加二抗酶标抗小鼠/兔IgG聚合物(购自福州迈新公司)，37 ℃温箱孵育30 min，DAB显色，镜下观察3～5 min至显色合适为止。苏木精复染，自来水冲洗返蓝，最后脱水、透明、固定。

1.3 结果判定 在高倍镜下随机选取5个不同的视野，观察细胞染色强度及计数阳性细胞数所占细胞总数百分比，评分标准：(1)按染色强度记分：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。(2)按阳性细胞所占百分比记分：阴性为0分，阳性细胞数≤10%为1分，11%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。最后将两项得分结果相乘：总分≤4分为阴性，>4分为阳性。

1.4 统计学分析 实验数据采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。临床病理特征与RYBP表达的相关性采用χ2检验，生存分析采用Kaplan-Meier法、单因素及多因素Cox回归分析，组间生存曲线采用Log-rank检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RYBP在胰腺癌和癌旁组织中的表达 RYBP在胰腺癌组织中呈阴性；癌旁组织中呈阳性，阳性部位主要位于细胞质和细胞膜(图1)。RYBP在胰腺癌中表达明显低于癌旁组织。RYBP在胰腺癌和癌旁组织中的阳性率分别为31.4%(16/51)和66.7%(34/51)，两组相比差异有统计学意义(χ2=8.925，P<0.05，表1)。

图1 RYBP在胰腺癌癌旁组织中呈阳性，SP两步法

表1 RYBP在胰腺癌和癌旁组织中的表达

2.2 RYBP表达与胰腺癌临床病理特征的关系 胰腺癌组织中RYBP表达与患者性别、年龄、吸烟、饮酒、肿瘤数目、有无淋巴结转移和血清CA199水平无明显相关性(P>0.05)，与肿瘤直径及肿瘤病理分级有相关性(P<0.05，表2)。

2.3 RYBP表达与胰腺癌患者预后的关系 对51例获得随访资料的胰腺癌患者采用Kaplan-Meier法进行生存分析，结果显示：RYBP蛋白高表达组患者的总生存率明显高于低表达组，用Log-rank进行组间生存率检验结果显示：RYBP蛋白低表达与胰腺癌患者预后不良相关(χ2=6.907，P=0.008 6，图2)。经Cox比例风险回归模型分析，单因素及多因素分析均显示RYBP蛋白表达、病理分级与患者预后相关(P<0.05，表3)，说明RYBP表达是影响胰腺癌患者预后的独立危险因素(HR=0.410，95%CI：0.170～0.986，P=0.046)，病理分级也是影响胰腺癌患者预后的独立危险因素(HR=3.697，95%CI：1.384～9.879，P=0.009)。

3 讨论

表2 RYBP表达与胰腺癌临床病理特征的关系

图2 Kaplan-Meier法分析RYBP表达对胰腺癌患者术后生存时间的影响

随着发病率和病死率的逐年增加，癌症已经成为困扰全球的重大公共卫生问题[3-4]。胰腺癌作为我国常见的消化道恶性肿瘤之一，近年来其发病率呈逐年上升趋势，已成为癌症相关死亡前10位的肿瘤。胰腺癌因其早期确诊率不高，发现时多数已处于中晚期，预后极差，全球范围内胰腺癌病死率高居第4位[5]，因此寻找新的胰腺癌早期诊断、靶向治疗以及判断预后的生物学标志物迫在眉睫。

表3 胰腺癌预后Cox模型分析

PcG相关蛋白RYBP是最早于1999年利用酵母双杂交技术从小鼠中筛选而出，由228个氨基酸残基组成的一个具有锌指结构域的碱性蛋白质[6]。人类RYBP蛋白在细胞质和细胞核中均有分布，在淋巴组织和胎盘内表达较高。天然状态下，RYBP处于非折叠状态，当与蛋白质或DNA相互作用时，其构象改变，蛋白质折叠[7]。RYBP还是经典的泛素结合蛋白，其自身被单泛素化，在个体发育过程中广泛表达[8]。近年研究发现RYBP与人类恶性肿瘤的发生、发展关系密切。RYBP在肿瘤中的表达高低存在差异。有研究表明RYBP在肝癌、肺癌、子宫颈癌、前列腺癌等组织中低表达并与患者预后不良相关[9-13]。在肝癌组织中RYBP表达明显低于癌旁组织，并可作为肝癌患者预后不良的独立因素。在非小细胞肺癌组织中RYBP蛋白及mRNA水平明显降低，且与患者预后不良密切相关，过表达RYBP可抑制细胞存活，诱导细胞凋亡，同时增加非小细胞肺癌细胞对化疗药物的敏感性，相反敲低RYBP的表达后这些现象发生逆转[11]。子宫颈癌中RYBP表达降低与患者放、化疗后存活率降低密切相关。Sanchez-Beato等[14]发现RYBP在部分肿瘤中表达升高，主要表现在垂体腺瘤、霍奇金淋巴瘤、T细胞淋巴瘤和少突胶质瘤。本实验通过观察胰腺癌及癌旁组织中RYBP的表达，进一步明确其在肿瘤组织中的表达。本组实验结果显示：51例胰腺癌组织中RYBP阳性率仅为31.4%(16/51)，癌旁组织中RYBP阳性率高达66.7%(34/51)，组间比较差异有显著性(P<0.05)，支持RYBP在胰腺癌中低表达的结论。

增殖、凋亡是正常及肿瘤细胞重要的生物学行为，RYBP可与细胞质和细胞核内多种蛋白相互作用，调控细胞增殖、凋亡。当前RYBP介导的凋亡已成为研究热点。酵母双杂交分析发现RYBP可与凋亡蛋白(apoptin)相互作用，凋亡蛋白突变导致其与RYBP结合减少，从而诱导细胞凋亡时间延迟，提示RYBP可通过凋亡蛋白调控细胞凋亡[15]。RYBP可与细胞质中的FADD、Caspase 8/10前体及细胞核中的DEDD相互作用，也可在细胞膜上通过增强CD95-FADD-Caspase 8复合体的形成，促进死亡受体和DEDD介导的细胞凋亡作用。最近Wang等[9]研究发现，RYBP表达与肝细胞癌患者肿瘤病理分级及肿瘤直径相关，同时在体外肝癌细胞株中过表达RYBP后肝癌细胞侵袭能力和凋亡增加，相反在用siRNA干扰RYBP的表达后该现象又发生逆转，说明RYBP调控的细胞凋亡与肿瘤发生、发展密不可分。本组实验发现，RYBP蛋白表达在不同肿瘤直径、病理分级间比较差异有统计学意义(P<0.05)，表明RYBP蛋白表达与胰腺癌肿瘤直径及病理分级具有相关性，提示RYBP介导的细胞凋亡可能在胰腺癌中发挥重要作用。近年研究发现，RYBP蛋白低表达与一些肿瘤患者的预后不良和(或)低生存率呈正相关[9-13]，这与本组实验结果一致。本组实验通过长期随访，进一步探讨RYBP蛋白表达与胰腺癌患者的远期生存率之间的关系。随访资料经Kaplan-Meier分析、单因素Cox回归及多因素Cox回归分析均显示RYBP蛋白表达与胰腺癌的预后有关，RYBP蛋白低表达提示患者预后差，因此RYBP蛋白表达可作为判断胰腺癌预后的指标之一。另外，单因素及多因素Cox回归分析显示病理分级与胰腺癌预后相关，说明病理分级是影响胰腺癌预后的重要因素。

综上，RYBP与胰腺癌发生、发展及患者预后密切相关，RYBP能否成为新的肿瘤标志物和分子靶向治疗的有效靶点，值得更进一步探讨证实。

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Expression of PcG related protein RYBP in pancreatic carcinoma and its clinical significance

LUO Wei1, ZHU Xiao-nian2, TAN Sheng-kui1,2

(1DepartmentofHepatobiliarySurgery,theAffiliatedHospitalofGuilinMedicalUniversity,Guilin541000,China;2SchoolofPublicHealth,GuilinMedicalUniversity,Guilin541000,China)

Purpose To investigate the expression and clinical significance of RINGI and YYI binding protein (RYBP) in pancreatic carcinoma (PC). Methods RYBP expression was detected in 51 cases of PC tissues and paired adjacent non-tumor tissues by immunohistochemistry. The correlation between RYBP expression and the survival time of PC patients after surgery was analyzed by Kaplan-Meier method. Results Compared to the expression in adjacent non-tumor tissues, RYBP was significantly lower expressed in PC tissues (P<0.05). In addition, RYBP expression had a significant correlation with tumor diameter and tumor staging of patients (P<0.05), but no significant correlation with other characteristics of patients, such as gender, age, smoking, alcohol intake, tumor number, metastasis or CA199 level (P>0.05). The survival analysis showed that the survival time of PC patients with positive expression of RYBP was significantly longer than patients with negative expression of RYBP (P<0.05). Conclusion RYBP is significantly lower expressed in PC tissues, which might be involved in the pathogenesis of PC.

pancreatic neoplasms; RYBP; cell apoptosis

时间：2017-2-27 10:14

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170227.1014.006.html

国家自然科学基金(81460515)

1桂林医学院附属医院肝胆外科，桂林 5410002桂林医学院公共卫生学院，桂林 541000

罗 伟，男，硕士研究生。E-mail: luoweidoctor@163.com 谭盛葵，男，教授，硕士生导师，通讯作者。E-mail: sktan2008@sina.cn

R 735.9

A

1001-7399(2017)02-0125-04

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.02.002

接受日期：2016-12-16