蔡展宇　苏广华

摘要：实验目的：在小尾寒羊的畜牧业良种繁育中，探索液氮气相存储技术应用于胚胎玻璃化冷冻的可行性。实验方法：采用小尾寒羊母羊作为胚胎的供体，利用超数排卵技术和体外输精之后，并且胚胎在供体羊体内发育的7天之后，将胚胎冲出。之后，利用新的玻璃化冷冻技术对所采集的胚胎进行冷冻处理，冷冻处理24小时之后复苏，之后移植同期发情蒙古母羊受体体内，并且以鲜胚移植同批发情母羊受体作为对照组。实验结果：玻璃化胚胎移植的妊娠率与胚胎的发育的不同阶段密切相关（fisher精确检验：p=0.01 8），CH（紧缩桑葚胚）的怀孕率显著高于BL（囊胚期）。实验结论：在气相液氮存储条件下，羊胚胎玻璃化冷冻采用紧缩桑葚期胚胎，能提高妊娠率。

关键词：胚胎移植；玻璃化；液氮蒸汽相存储；低温生物学

低温保存胚胎技术是优良种畜生育和种群扩大的重要组成技术。从1985年Rail和Fahv使用玻璃化冷冻法成功地冷冻了小鼠胚胎（Rall&Fahv 1985）以来，玻璃化已成为常规的低温动物胚胎保存技术之一，广泛用于动物和人的胚胎保存中。玻璃化形成于-80℃--130℃，在这个转变温度以下，分子运动和化学转化都会停止，胚胎等生物样品可以无限期地保存，因此是种群保存、动物基因克隆建库、运输和胚胎移植等应用的有效手段（Woods，Benson，Agca&Critser，2004）。在当前的玻璃化冷冻技术中，胚胎等生物活性-样品通常被储存在液氮液体内，温度是-196℃，大大低于玻璃化形成所需要的温度，液氮液体存储具有价格低廉并普及的优点。然而，液氮蒸气相中同样可以实现低温样品的保存，被称为气相存储，目前已有很多商品化的液氮气相存储装置可供选择。液氮气相存储具有以下优点：1）可避免共处一个液氮池中的各样品之间发生潜在的相互污染以及防止传染介质在其中的传播；2）由于存储温度在-130℃--150℃，长期存储可以节约液氮的使用，从而降低成本提高经济效益；3）可以防止样品的碎裂现象发生，在玻璃化冷冻中有一个问题是碎裂，这通常发生在较大的样品中（mL体积以上），碎裂会发生在大幅低于玻璃体形成温度的以下温度，例如液氮液体温度（-196℃）。防止样品碎裂发生要求生物样品存储的温度保持在玻璃体形成温度以下10摄氏度到20摄氏度之内，例如：-130℃到-150℃之间，这就要求进行气相存储。我们设计并制作了一种恒定温度在-140.5℃的液氮气相存储装置，在此次试验中玻璃化冷冻小尾寒羊供体的胚胎，在本次实验证明有效，并申请了专利保护。

目前，对于在液氮气相玻璃化冷冻绵羊胚胎并应用于胚胎移植，报道和研究较少，我们设计进行这种玻璃化胚胎冷冻的试验，同时使用鲜胚移植作为阳性对照，以验证试验方法及试验过程的可靠性，探索液氮气相存储玻璃化冷冻在绵羊胚胎移植中应用技术。通过对小尾寒羊在气相液氮装置进行胚胎玻璃化冷冻，解冻后进行胚胎移植，为绵羊优良种畜生育和种群扩大探索新的低温技术，最终为胚胎移植技术的改进和低温冷冻设施的改良奠定基础。这对于绵羊的良种育种和良种扩大，都有很大意义。

1.材料与方法

1.1实验设计

以30只小尾寒羊作为供体以三种FSH（卵泡刺激素），分别为加拿大（Canada），宁波（Ningbo）和中科院（CAS）进行超排卵，并进行人工授精。120只蒙古羊同期发情作为胚胎移植受体。冲洗取出受精的胚胎，按形态学标准对胚胎分级。取50枚胚胎进行气相条件下玻璃化冷冻，并在自制的液氮气相装置中温度控制在-140℃过夜，24h后解冻，并且移植25只蒙古羊，每只羊移植两枚胚胎。作为对照组，以50枚新鲜采集的胚胎移植另外25只蒙古羊作为阳性对照组，同样每羊移植2枚新鲜采集的胚胎。

1.2气相液氮装置的制备：

所用装置按本实验进行设计和制作，存储空间为液氮的蒸汽相（气相），可以保证实现存储室的温度不超过-140.5℃的温度范围，有效克服气相冷冻装置温度变化大的缺点。进行验证后，此装置已被申请发明专利，发明名称：恒定低温存储系统及去除杜瓦雾气的方法。申请号为：CN201710024975.1

注：在过夜玻璃化冷冻所存储的胚胎中，x轴为时间从凌晨0：00到下午16：48的温度监控。Y轴为温度变化。如图所示：T Bottom为气相存储室底部的温度探头所检测到的温度，T Top为气相存储室顶部的探头所测温度，T Center为气相存储室中部的探头所测温度；以上温度探头均为OMEGA的热电偶，Tc为RTD类型的温度探头。Tset（PID）proportional-integral-derivative控制器作为本装置的控制单元。PID单元的控制温度加上一个补偿值来和实际温度相一致。

1.3主要药品：

羊用同期发情阴道栓（CIDRG，20枚/包新西兰），Controlled drug release dispenser，简称CIDR。供体用CIDR+LH+FSH进行同期发情和超数排卵，受体用CIDR+LH进行同期发情；中科院动物所生产的FSH，规格10mg/瓶；加拿大Bioniche公司生产的FSH，规格为400mg（20mL）/盒；宁波激素制品厂生产，规格为100IU/支。促黄体素（LH）为宁波激素制品厂生产，规格为200IU/支。胚胎培养保持液（Complete Embryo holding medium 100ml/瓶，新西兰）、供体羊冲卵用营养液（Complete Embryo flush solution，1000 ml/袋，新西兰）。

1.4试验时间及地点：

试验于2016年3月～6月进行，牧区为内蒙古呼和浩特和羊牧场。同期发情、超数排卵、配种和胚胎收集也都在和羊牧场进行，方法按照相关标準流程进行（Gibbons A.，Gueto M.，2011）。对120只蒙古羊进行同期发情处理作为胚胎移植的受体羊，在2016年3月27日-28号总计采集到147枚可供移植的胚胎，其中，对3月27日采集的56枚胚胎进行玻璃化冷冻处理，剩余胚胎在3月28日进行采集，作为对照，进行鲜胚移植。

1.5方法

1.5.1供体羊超数排卵

在内蒙古呼和浩特市郊区和羊牧场，选取30只小尾寒羊作为供体，以三种FSH（卵泡刺激素），分别为加拿大（Canada），宁波（Ningbo）和中科院（CAS）。供体均采用阴道栓诱导同期发情。在放栓第11d撤栓，分别注射三种FSH。本研究第1次注射总剂量为138 u，分6次递减注射（28、28、23、23、18、18 u），每天上午、下午各注射1次。在第5次、第6次注射之问注射1次LH（80-130 U）。

1.5.2供体羊人工输精

超排处理后发情当日，将使用假阴道法采集的同种公羊精液稀释4倍，使用腹腔内子宫角输精技术，将0.25 ml稀释精液输入供体子宫角前端。

1.5.3冲胚及胚胎质量认定

在人工腹腔镜输精后的第7 d进行冲胚。手术前，清洗供体羊手术部位并剃除腹部细毛，实施麻醉，腹中线一侧手术切口，暴露子官角及卵巢，在确认黄体出现之后按照子宫冲胚的方法进行冲胚。之后，在体视镜下对冲出的囊胚进行分级（0verstrom 1996），分为CM（（compacted morula）紧缩桑葚胚、BL（blastocyte）囊胚、ExB（Expanded Blastocyte）扩大囊胚、以及HB孵化囊胚（hatched blastocyst）和未受精等。

1.5.4玻璃化冷冻胚胎和复苏方法

选取三个发育阶段的胚胎fCM，ExB，BL）进行玻璃化冷冻：采用含有20%乙二醇（ethylene glycol，EG）+20%二甲基亚砜（dimethyl sulphoxide.DMSO）的L-15溶液做为玻璃化冷冻的浓储液。将选取的胚胎依次移人4℃的含有25%、50%、75%和100%浓度用L-15稀释的玻璃化冷冻浓储液中各2.5 min，最后将胚胎装进含有100%的胚胎玻璃化冷冻浓储液的胚胎冷冻管中，之后移入到我们自主研发的-140.5℃的气相恒温罐当中。复苏时，在储存罐中取出胚胎，迅速将其投入室温的水浴当中，当液体完全溶解之后，將其依次转移到含有0.5，0.25和0.125 mol/L蔗糖的L-15溶液中各5min，之后放入培养液中37℃培养箱中静置备用。

1.5.5胚胎移植

用自制输卵器将7日龄的囊胚移植到经同期发情处理后的蒙古羊作为受体羊的子官角前1/3处，移植后注射1ml黄体酮。对3月27日采集到的56个胚胎在特制的液氮气相冷冻装置中进行玻璃化冷冻，过夜后于3月28日对经过玻璃化冷冻的胚胎进行解冻处理，其中50枚胚胎在解冻后，采用腹腔手术法移植A25只发情处理的蒙古母羊体内，每羊两枚胚胎。作为对照组，挑选50枚新鲜采集的小尾寒羊的胚胎移植到25只发情处理的蒙古母羊体内，采用同样手术方法，由内蒙古大学实验动物中心同一支研究队伍进行手术操作。方法参照Gibbons&Gueto，201 1进行。

1.5.6妊娠观察

胚胎移植后三个月之内采用B超方法确认怀孕。在胚胎移植后6个月随访确认无流产和畸形胚胎的产生。

1.5.7统计分析：

统计采用Fisher精确检验。

2.实验结果

2.1在对照组（鲜胚移植）怀孕率为80%，在玻璃化冷冻胚胎组，怀孕率为38%

2.2胚胎移植的怀孕率

·缩写：CM：紧缩桑葚胚；B：胚囊期；ExB：扩大胚囊期

·耳号为9029 and 9015分别被接种了1只和3只紧缩桑葚胚，并且都成功受孕

2.3实验结论

玻璃化胚胎移植的怀孕率与胚胎的发育阶段密切相关（fisher精确检验：p=0.018），在CM（紧缩桑葚胚）的怀孕率显著高于BL（囊胚期）。在液氮气相玻璃化冷冻中，CM胚胎对于玻璃化过程及其融化过程和高浓度的玻璃化保护液具有较高的耐受性，后期的受体羊的妊娠情况明显优于其他时期。鲜胚的胚胎移植成功率高于液氮气相冷冻胚胎。这同文献记载相一致。液氮蒸气相玻璃化胚胎进行移植的怀孕成功率与液氮液相玻璃化胚胎的怀孕成功率相似。鉴于液氮气相玻璃化存储的优点，气相玻璃化冷冻技术在动物良种繁育中是一种很有竞争力的选择。

3.讨论

使用玻璃化技术进行胚胎冷冻，可以有效降低种羊繁育成本，对绵羊的优良种群进行扩繁有很大意义。本实验在内蒙古和羊牧场由同一支研究队伍对实验组和对照组进行操作，有效避免了不同方法和不同手术操作引入的试验误差。本实验中新鲜胚胎的移植达到80%的受孕率，这与国外的相关报道相一致（Gibbons&Gueto，2011）。使实验结果与其它研究报道相互印证，具有较高的可信度。

在高等哺乳动物的桑葚期的胚胎可分以被为早期、中期和晚期三个阶段。早期桑葚阶段，胚胎细胞似有相互‘融合”（compact）之势，但单个细胞仍可辨认，被称为紧缩桑葚胚（CM）；到了桑葚胚中期，胚胎细胞进行“融合”，形成一个大而圆的细胞球（morula），细胞膜的界限不再清晰，低倍镜下整个胚胎看似一个大细胞，称为桑葚胚；晚期桑葚胚的细胞界限重新显现，细胞数量较“融合”前明显增多，部分细胞尤其是周边细胞呈梭形，细胞之间可出现小腔隙，形成初期的囊胚腔即早期囊胚。有研究认为桑葚胚玻璃化冷冻在妊娠率和胚胎种植率达到了卵裂期胚胎水平，在胚胎种植率方面并优于卵裂期胚胎。并具有很多优点：如具有细胞骨架，易于冷冻保护剂渗透，经过4天培养，可以剔除无潜力胚胎、降低筛选的工作量，且不需要人工皱缩等，桑葚期胚胎的冷冻较囊胚冷冻经济、方便，在冷冻胚胎的移植中值得推广（曹金凤等，2013）。由于各地采用的供体和受体的品种、年龄、体况各异，操作技术及试验条件不同，所以移植结果有所不同（王锐等，2005）。对于琉璃化冷冻羊胚胎的移植效果也有不同的水平。道赛特等绵羊冻胚移植中，囊胚的受胎率显著高于桑葚胚（王丽娟，2003）。在杜泊羊上，囊胚的受胎率显著高于桑葚胚（陈永昌，2004）一般认为处于桑葚胚前的胚胎的移植效果好、受胎率较高。但本研究中，以蒙古羊受体，小尾寒羊的桑葚胚移植受胎率高于囊胚期，和其它一些研究结果相一致（吐尔洪.阿木提等，2016）。

目前已有高质量的商业化绵羊冻胚移植服务，成功率约为40%左右（奥群牧业n.a.），本次玻璃化冷冻胚胎的移植总体成功率38%略低于这—水平。但是商品化运营的胚胎移植，选用移植成功率较高阶段的胚胎（如桑葚胚和囊胚期）进行玻璃化冷冻和解冻。而在本试验研究中，以紧缩桑葚胚的移植受孕率则高于这一数字，达到48%，说明气相液氮装置在玻璃化冷冻胚胎的受孕成功率可以达到商业化胚胎移植的水平。也论证了此种气相液氮装置应用于绵羊胚胎玻璃化冷冻的可行性。

本试验选用三种FSH进行对比，对于胚胎超排而言无显著差异，证实宁波产FSH适用于冷冻羊胚胎的移植。通过进一步完善相关操作流程，及羊场实验条件，玻璃化胚胎的移植成功率应当还有进一步的提升空间。