焦艳华

(杭州师范大学材料与化学化工学院，浙江 杭州 310036)

活细胞化学发光检测方法的研究

焦艳华

(杭州师范大学材料与化学化工学院，浙江 杭州 310036)

目前各种微生物快速检测技术依然存在一定的问题，尚未有一种方法能够真正达到检测速度快、检测准确率高并且检测限低的要求.本文以活细胞胞内酶作为检测靶点，以自制的1,2-二氧环乙烷衍生物作为化学发光底物，研究了反应时间、缓冲液pH值等对化学发光强度的影响，研究构建一种微生物活菌化学发光检测的新方法.

活细胞；化学发光；化学发光底物；检测

细胞活性检测方法很多,如细胞计数法、单细胞克隆法、MTT比色法、荧光染色法和ATP(三磷酸腺苷)生物发光法等[1].MTT比色法是利用活细胞的线粒体脱氢酶在代谢过程中将黄色的可溶性四唑盐MTT还原为不溶于水的蓝紫色产物-甲臜(Formazan)晶体,其生成量与活细胞数量和细胞活化状态呈线性关系[2].MTT比色法以其简便、灵敏、稳定、重复性好而广泛用于检测培养细胞的生长和增殖、评价化学物的细胞毒性以及恶性肿瘤的体外药敏试验[3].但是MTT法有无法克服的弱点：Formazan的生成受作用时间的影响，样品较多时测定的光吸收值随时间而变，会增加实验误差.对悬浮细胞来说，经MTT染色后，用二甲基亚砜(DMSO)溶解后，必须将每孔中的细胞吸出，离心去除上清，沉淀用DMSO溶解后再测定光吸收值，操作繁琐.荧光染色法也是检测细胞活性常用的方法[4].Regel等人曾用FDA(双醋酸荧光素)单染色法对铜绿微囊藻和月牙藻的活性进行检测[5].FDA-PI(碘化丙锭)双色荧光法是Jones等人第一次在动物细胞活性鉴定方面提出的方法,对染色后的样品,检测手段可以采用荧光显微镜进行图像观察和计数[6],用荧光分光光度计测定细胞活性的强弱和生物量[7-8],或采用流式细胞法测定细胞数量和生物量[4-5].ATP生物发光法是20世纪80年代发展起来的一种检测技术，ATP既是荧光素酶催化发光的必需底物，又是所有生物生命活动的能量来源，每种微生物细胞中的ATP含量是恒定的.通过测定样品中的ATP浓度，即可推算出活菌数[9].ATP生物发光法的检测过程无需细胞培养，操作简便，在短时间内即可得到检测结果，是目前检测微生物最快的方法之一.但是ATP生物发光法存在非菌类的“游离ATP”和其他成分干扰的问题，如何简易可靠地去除这个本底信号而又不影响“微生物ATP”检测的灵敏度目前还没有得到有效解决.如果ATP提取过程处理不当的话也会产生假阳性信号[10].

微生物活细胞常含有广谱水解酶活性，如碱性磷酸酶、糖苷酶、酯酶等.这些酶可以水解带有相应特异基团的1,2-二氧环乙烷衍生物(如AMPPD)等，其水解产物在室温下不稳定而会产生化学发光.碱性磷酸酶(ALP)和1,2-二氧环乙烷类构成的发光体系(ALP-AMPPD)是目前最重要、最灵敏的一类化学发光体系，对ALP的检测限可达10-21mol/L，是一种有效的微量和痕量分析体系.本文选用常用的模式菌大肠杆菌，以自制的1,2-二氧环乙烷衍生物作为化学发光底物，探索一个对胞内酶或代谢活性产生化学发光的最佳试剂体系，研究构建一种微生物活菌快速检测的新方法.

1 实验部分

1.1 试剂

实验中所用试剂间羟基苯甲酸和2-金刚烷酮为市售化学纯，正丁纯、PCl3、TiCl4、Zn粉、聚乙二醇(PEG)、虎红及亚甲基蓝等都是分析纯试剂，购自阿拉丁试剂公司，使用前按标准方法提纯干燥.

DXT-880多功能酶标仪，美国beckman公司；96孔板：北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；水浴摇床：河南巩义市固化仪器厂；恒温培养箱：河南巩义市固化仪器厂.

1.2 双亲性化学发光底物的制备与结构

由于微生物活细胞常含有广谱水解酶活性，如碱性磷酸酶、脂肪酶等，本文按照文献分别合成了与之对应的碱性磷酸酶底物和脂肪酶底物(图1、图2所示)[11]，初步研究了它们的综合性能，包括溶解性、稳定性及发光效率.对于碱性磷酸酶底物，实验结果表明随着取代基R1碳链的增长，发光效率略有降低但影响不是很大，但随着R1碳链的增长，其水溶性会降低，因此选择碳链适中的取代基(R1为正丁基)作为碱性磷酸酶的发光检测试剂.而对于脂肪酶底物，选择R2=PEG-200的化合物作为脂肪酶的检测发光试剂.

(R1=C1～C10的烷基)图1 碱性磷酸酶底物Fig. 1 The chemiluminescent substrate of the alkaline phosphatase

(R2=PEG-200～PEG-800)图2 脂肪酶底物Fig. 2 The chemiluminescent substrate of lipases

1.3 化学发光检测方法

取OD600大约为0.6的大肠杆菌或酵母菌溶液20 mL，在超声波功率400 W、总时间10 min、工作时间6 s、间隔时间5 s的条件下，于冰浴中进行破碎处理，1000 r/min高速离心10min得上清液.取20ul上清液，加100ul适宜的缓冲体系，然后分别加入30ul实验室合成的1,2-二氧环乙烷类化学发光底物溶液(1mM,脂肪酶底物、碱性磷酸酶底物)，混匀，用多功能酶标仪检测其化学发光强度.

2 结果与讨论

2.1 化学发光检测原理

本文采用1,2-二氧环乙烷类衍生物作为化学发光检测试剂，其基本原理和AMPPD-碱性磷酸酶(ALP)体系一样，如图3所示，即AMPPD在ALP的催化作用下，磷酸酯基发生水解迅速脱去磷酸基，得到一个不稳定的中间体AMPD阴离子，然后这个AMPD阴离子会裂解成为一个金刚烷酮分子和一个处于激发态的间氧苯甲酸甲酯阴离子.激发态间氧苯甲酸甲酯离子跃迁到基态的过程中，会产生477 nm的光，可持续几十分钟释放.AMPD一般有2～30 min的半衰期，所以当反应超过30 min时，反应的发光强度基本处于稳定状态，当延长检测时间，反应的光强度也是基本保持不变的.

图3 AMPPD-ALP体系化学发光示意图Fig. 3 The reaction scheme for AMPPD-ALP

图4 化学发光强度随时间的变化Fig. 4 Effect of reaction time on the chemiluminescence intensity

2.1.1 化学发光检测时间的选择

取一定浓度的大肠杆菌活菌破碎液20 μL，加入二乙醇胺缓冲体系100 μL，然后分别加入30 μL的1 mM的1,2-二氧环乙烷类化学发光底物溶液(碱性磷酸酶底物、脂肪酶底物)，混匀，用多功能酶标仪检测此发光体系的化学发光强度，每隔5 min记录一次数据，从图4中可以看出随着时间的延长，发光强度逐渐变强，但到了15 min之后，发光强度稍有下降，然后可以维持很长一段时间基本不变，所以我们选择测定的时间是15～20 min之间.

2.1.2 缓冲液的选择

为了研究缓冲液对化学发光强度的影响，实验中以大肠杆菌为模式菌，分别采用二乙醇胺缓冲液(pH=10.0)、碳酸盐缓冲液(pH=9.5)、Tris缓冲液(pH=8.5)，实验结果见表1.

表1 缓冲液对化学发光强度的影响Tab. 1 Effect of the pH value on the chemiluminescence intensity

从表1中的数据可以看出对于碱性磷酸酶底物及脂肪酶底物来说，二乙醇胺缓冲体系检测的发光强度最高，其次是碳酸盐缓冲液，最差的是Tris缓冲体系，因此较合适的缓冲液是二乙醇胺，其pH值为10.0.

2.1.3 不同活菌的检测

为了比较不同活菌里含有活性水解酶种类，本文分别以实验室已有的菌种(毕赤酵母GS115及人工大肠杆菌)为模式菌，检测相同浓度下活菌破碎液与实验室合成的1,2-二氧环乙烷类化学发光底物(脂肪酶底物、碱性磷酸酶底物)作用，加入二乙醇胺缓冲体系，用多功能酶标仪检测其化学发光强度.结果如表2所示.

表2 活菌种类对发光强度的影响Tab. 2 Effect of viable bacteria on the chemiluminescence intensity

从表2可以看出，毕赤酵母和大肠杆菌的活菌破碎液与碱性磷酸酶底物及脂肪酶底物在一定的缓冲体系下都有化学发光信号产生，并且与脂肪酶底物作用时发光信号更明显.这可能是因为毕赤酵母GS115及人工大肠杆菌中脂肪酶含量更高的原因.

3 结 论

将一定浓度的活菌超声破碎后，加入自制的1,2-二氧环乙烷衍生物(脂肪酶底物、碱性磷酸酶底物)，加入合适的缓冲体系，用多功能酶标仪能够检测到明显的化学发光.最佳检测pH值范围为9.5-10.0，检测时间为15～20 min之间.

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On Chemiluminescence Detection of Living Cells

JIAO Yanhua

(College of Material, Chemistry and Chemical Engineering, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China)

At present various microbes rapid detection technology still exists certain problems, there is no way can truly achieve the requirements of rapid detecting speed, high accuracy and low detection limit. Taking the enzymes in living cells as the test targets, with a synthetic chemiluminescent substrate as the detection reagent, a new method of chemiluminescence detection of microbial bacteria is studied. In order to optimize various assay conditions, the effects of reaction time and the pH of the buffer on the reaction time for chemiluminescence intensity are researched.

living cells; chemiluminescence; chemiluminescent substrate; detection

2016-05-10

国家自然科学基金项目(21005025);杭州市科技发展计划项目(20130533B14).

焦艳华(1976—)，女，副研究员，博士，主要从事化学发光免疫分析、功能性化合物的合成及应用研究.E-mail：yhjiao@hznu.edu.cn

10.3969/j.issn.1674-232X.2017.02.006

O657.39

A

1674-232X(2017)02-0148-04