陈 颖，王 茉，景莉君，张 宁，陈书琴，韦英杰＊＊

（1.南京中医药大学第三临床医学院 南京 210028；2.江苏省中医药研究院 国家中医药管理局中药释药系统重点研究室 南京 210028；3.中国人民解放军93038部队医院 通化 135300）

基于斑马鱼模型筛选壮骨关节丸毒性药味高效筛选＊

陈 颖1，2，王 茉3，景莉君1，2，张 宁1，2，陈书琴1，2，韦英杰1，2＊＊

（1.南京中医药大学第三临床医学院 南京 210028；2.江苏省中医药研究院 国家中医药管理局中药释药系统重点研究室 南京 210028；3.中国人民解放军93038部队医院 通化 135300）

目的：采用斑马鱼模型高效筛选壮骨关节丸中有毒性的药味。方法：将受精后1天（1 day post fertilization，1dpf）的斑马鱼胚胎暴露于壮骨关节丸及方中12种药味不同浓度水煎液和醇提液中，观察记录给药后2-6 dpf或2-8 dpf的死亡数量，于3 dpf显微检视斑马鱼幼鱼状态，SPSS软件计算6 dpf的斑马鱼半数致死浓度LC50。结果：斑马鱼暴露于壮骨关节丸及补骨脂、续断、乳香没药、独活和木香的水、醇提取液，以及鸡血藤和狗脊的醇提液毒性较大，致鱼卵黄囊肿大、变形或变黑，提示与肝毒相关，6 dpf鱼的LC50为33.2-392.7 μg·mL-1（已折算为生药量，下同）；淫羊藿水、醇提取液均在1 500 μg·mL-1致鱼卵黄囊肿大、变黑，LC50为1 100-1 350 μg·mL-1，有一定毒性；鸡血藤和狗脊的水煎液，以及骨碎补、桑寄生和熟地黄的水、醇提取液未致鱼脏器明显改变，LC50大于1 500 μg·mL-1，故安全性较好。结论：斑马鱼模型高效辨识了壮骨关节丸不同药味毒性差异，可实现复杂中药中潜在毒性物质的在体、实时、动态、规模化的高效筛选。

壮骨关节丸 斑马鱼 毒性药味 肝毒性

近年来，壮骨中药的肝毒性引起重视，有些疗效确切、临床用药广、关注度高的知名中成药如壮骨关节丸、仙灵骨葆胶囊等有肝脏不良反应，其肝损害不良反应已在《药品不良反应信息通报》公开[1-3]，为临床安全用药带来极大挑战。高效辨识其毒性根源具有意义。

现有体内、外毒性模型无法兼顾在体与高效评价：哺乳动物安全性评价耗时长、成本高、劳动强度大，不适于高效筛选；体外细胞模型环节单一，无法体现在体效果。斑马鱼是弥补现有体内、外模型不足的理想模式生物，斑马成鱼个体小，便于大规模养殖，养殖成本低，产卵量多，遗传背景清楚，其基因与人类相比有85%的相似度。斑马鱼胚胎体外受精，体外发育，胚胎发育同步且速度快，可于微板中实验，已成为国际上药物安全性和疾病研究的热门模式生物[4-7]。

壮骨关节丸为中国药典收载，是最早在药品不良反应信息通报发布(2001年第1期和2008年第16期)有肝毒的壮骨中成药。壮骨关节丸的肝毒性虽引起重视[8-9]，但致毒根源研究进展较慢，仅见周昆等[10]筛选壮骨关节丸中肝毒性药材研究，采用Beagle犬，按照故障排除法将壮骨关节丸全方拆分为最可能组(补骨脂组)、可能组(淫羊藿加独活组、乳香加没药组)、最不可能组(熟地组、续断加狗脊和鸡血藤组、骨碎补加桑寄生和木香组)，初步寻找出其中引起肝损害的药材组。由于大动物Beagle犬实验周期长，劳动强度大，成本高等因素，未能实现对方中12味药的毒性分别筛查，难于辨别各药的毒性强弱。本研究用斑马鱼高效评价方中12味药的水煎液及醇提物安全性，以期明确壮骨关节丸的毒性根源，为深入研究其毒性物质基础提供实验依据，为应用模式动物斑马鱼进行中药复杂体系毒性高效筛选提供参考。

1 材料与仪器

1.1 动物

斑马鱼成鱼由南京大学模式动物研究所提供，来自德国tuebingen品系。

1.2 试药

壮骨关节丸(ZGGJW，华润三九医药股份有限公司，批号：1212003S)；狗脊（GJ，四川，安徽井泉中药饮片）、淫羊藿（YYH，东北，安徽井泉中药饮片）、独活（DH，湖北，南京海源中药饮片）、骨碎补（GSB，甘肃，安徽井泉中药饮片）、续断（XD，湖北，安徽井泉中药饮片）、补骨脂（BGZ，云南，南京松龄中药饮片）、桑寄生（SJS，广西，亳州市万珍中药饮片）、鸡血藤（JXT，广西，安徽井泉中药饮片）、熟地黄（SDH，河南，南京松龄中药饮片）、木香（MX，云南，南京松龄中药饮片）、乳香（醋炙）（RX，广东，亳州万珍中药饮片厂）、没药（醋炙）（MY，广西，亳州万珍中药饮片厂）。以上药材均来源于江苏省中西医结合医院药剂科。

1.3 仪器

Nikon Aphaphot-2 YS2显微镜(日本Nikon尼康公司)；生化培养箱SPX-80(宁波海曙赛褔实验仪器厂)，Olypus stylus TG-4相机（日本Olypus公司）；水为Milli-Q system高纯水(Millipore， Bedford， MA，USA)。

2 方法

2.1 供试液制备

壮骨关节丸供试液制备：取壮骨关节丸，研成粉末，称取粉末100mg，加入DMSO 0.4 mL助溶，加50 mL培养基稀释，100℃水浴30min，离心后将药液定容至50 mL，配制成2 mg·mL-1的母液，临用前用培养基适当稀释，分别配制成12.5，25，0，100，200， 300，400 μg·mL-1供试液供鱼毒测试。

水煎液（Water decoction，WD）或醇提液（Ethanol extract，EE）制备：将各药味分别粉碎，分别称取3.0-5.0 g（其中乳香没药按1：1称取），加水煎煮或80%乙醇提取2次，每次30分钟，合并两次滤液，浓缩至无醇味，配成10 mg生药·mL-1贮备液，置-20℃冰箱保存，临用前用培养基适当稀释，分别配制不同浓度的供试液供鱼毒测试。另用20 mmol·L-1对乙酰氨基酚培养基溶液作为肝毒阳性对照。

2.2 斑马鱼给药

选取健康雌、雄斑马鱼成鱼以雌雄自然交配，收集受精卵，于光照培养箱内28.5 ℃中发育，得到1dpf（day post fertilization）的胚胎备用。取斑马鱼发育正常的胚胎置24孔板中，每孔6个胚胎3组，分别暴露于不同浓度的供试液中，每孔2.0mL溶液，用培养基做空白对照。以卵凝结、心脏停跳作为死亡终点，每天计数胚胎和/或幼鱼死亡数量至6dpf或8dpf（壮骨关节丸），显微观察3dpf鱼的形态并拍照。

2.3 LC50计算

用Excel软件对鱼死亡数据进行分析；利用数据统计软件SPSS16.0计算壮骨关节丸中不同药味对6dpf的斑马鱼半数死亡浓度LC50。

3 结果

3.1 显微检视结果

斑马鱼胚胎暴露于壮骨关节丸及各药味不同浓度溶液48h后，在显微镜中下观察并记录斑马幼鱼（3dpf）状态。

斑马鱼暴露壮骨关节丸2天后，50 ug·mL-1鱼脏器形态与培养基组相当，未见明显毒性，100 ug·mL-1及以上浓度壮骨关节丸的幼鱼心包略肿大、出血，卵黄囊肿大、变形严重，色变黑（图1）。

各药味组鱼与培养对照组斑马幼鱼相比，发现水煎液和醇提液毒性均较大的有补骨脂、续断、乳香没药、独活和木香，呈现不同程度的脏器中毒现象，如卵黄囊肿大、畸形、变黑，心包肿大、出血、脊柱弯曲或色斑减少等，中毒浓度在15～500 μg生药·mL-1，值得注意的是补骨脂醇提液毒性远大于水煎液，醇提液致鱼中毒浓度约为水煎液的1/6至1/8，而续断水煎液的毒性远大于醇提液，醇提液致鱼中毒浓度约为水煎液的33倍；淫羊藿水煎液和醇提液均在1500 μg生药·mL-1致鱼卵黄囊肿大、变黑；鸡血藤与狗脊的水煎液安全性好，未见鱼脏器明显改变，但醇提液均有较大毒性，鸡血藤致鱼胚胎不能正常孵化，狗脊在500 μg生药·mL-1时心包肿大，出血，卵黄囊肿大、变黑。骨碎补、桑寄生、熟地黄水煎液和醇提液均未致鱼脏器明显改变（图1）。

图1 斑马鱼(3dpf)暴露壮骨关节丸及各药味的显微检视照片

3.2 各药味对斑马鱼胚胎及幼鱼至死率结果

观察并记录斑马鱼胚胎暴露于各浓度溶液2-6dpf的死亡数，计算死亡率，发现壮骨关节丸及各药味致斑马鱼死亡率与给药浓度和时间密切相关（图2）。1dpf斑马鱼暴露壮骨关节丸2-3天后，100-400 μg·mL-1组鱼全部死亡，12.5-50.0 μg生药·mL-1组鱼给药期间至1dpf少量（小于10%）或未见死亡。1dpf斑马鱼暴露各药味后，致鱼脏器毒性大的几种药味致鱼全部死亡的浓度较低，补骨脂、续断、乳香没药、独活和木香水煎液致鱼100%死亡的浓度范围分别500、20-100、150-1 000，500-1 000 和500-1 000 μg生药·mL-1，醇提液致鱼100%死亡的浓度分别40-80、200-1 000、100-1 000，500-1 000 和500-1 000 μg生药·mL-1，可见补骨脂醇提液和续断水煎液毒性分别远大于补骨脂水煎液和续断醇提液，浓度差8-10倍；淫羊藿水煎液和醇提液最大给药浓度2 000 μg生药·mL-1致鱼死亡率分别为87.5%和100%，而骨碎补相同浓度致鱼死亡率低于70%；鸡血藤和狗脊的醇提液毒性均大于水煎液，致鱼全部死亡的浓度范围均为500-4 000 μg生药·mL-1，而其水煎液最大给药浓度（3 000和4 000 μg生药·mL-1）均未见鱼100%死亡；桑寄生、熟地黄水煎液和醇提液致鱼100%死亡最小浓度均大于3 000 μg生药·mL-1，安全性较好。

图2 壮骨关节丸及各药味水煎液和醇提液致斑马鱼死亡的时-量-毒关系

图2 壮骨关节丸及各药味水煎液和醇提液致斑马鱼死亡的时-量-毒关系

续图2 壮骨关节丸及各药味水煎液和醇提液致斑马鱼死亡的时-量-毒关系

图3 各药味水煎液和醇提液的斑马鱼（3dpf和6dpf）半数死亡浓度LC50值

SPSS16.0计算3dpf和6dpf鱼的各药水煎液和醇提液的半数致死浓度LC50（图3），对于少量死亡未能计算LC50值的暂以最大给药浓度计，各药3dpf和6dpf的LC50大小趋势变化不大，值得注意的是鸡血藤醇提液6dpf时LC50值显著降低，仅约为3dpf时LC50值的1/10，提示鸡血藤醇提液对斑马鱼胚胎毒性低于对幼鱼毒性。兼顾醇提液和水煎液的LC50值由小到大，综合考虑鱼脏器毒性变化，可初步推测各药味鱼毒性由大到小顺序为：补骨脂、续断、乳香没药、木香和独活的毒性较大；其次鸡血藤醇提液和狗脊醇提液及淫羊藿有一定毒性；骨碎补的LC50值与淫羊藿相近，但高浓度2 000 μg生药·mL-1组鱼未见明显脏器改变，提示相对安全；鸡血藤水煎液、狗脊水煎液、桑寄生和熟地黄安全性好。

4 讨论

本文针对现在哺乳动物毒性模型难于高效筛选复杂有毒中药如壮骨关节丸的致毒根源，采用斑马鱼毒性模型快速评价了壮骨关节丸及各药味水煎液和醇提液的毒性差异，主要考查了1dpf胚胎至6dpf幼鱼的脏器形态和死亡率。

斑马鱼毒性模型是近年来被国内、外广泛关注并认可的药物安全性高效评价模型，斑马鱼胚胎发育快，受精后3天（3dpf）心脏等脏器基本发育完全孵出，3dpf斑马幼鱼刚孵出不易动，鱼体透明，易于在显微镜下侧卧检视卵黄囊、心脏等脏器形态，4dpf后斑马鱼活跃，5dpf肝脏发育完全，卵黄囊不断被吸收，不易侧卧捕获脏器形态。本实验观察1dpf-6dpf的毒性，旨在兼顾试药对胚胎发育及幼鱼的影响。斑马鱼卵黄囊成分的70%为中性脂质，主要在肝脏中代谢，因此卵黄囊大小可作为反映肝功能的指标之一[11， 12]。

本实验用斑马鱼验证了壮骨关节丸毒性，并发现有些传统认为相对安全的药味对鱼具有明显毒性：壮骨关节丸（100-400 μg·mL-1）及补骨脂、续断、乳香没药、独活和木香的水、醇提取液，以及鸡血藤和狗脊的醇提液在较低浓度（17.5-400 μg生药·mL-1），淫羊藿水、醇提取液（1 500 μg生药·mL-1）致3dpf斑马鱼卵黄囊肿大、变形或变黑，提示与肝毒相关，且上述各药（除淫羊藿外）6dpf鱼的LC50值较小（33.2-392.7 μg生药·mL-1），提示毒性较大，值得注意的是补骨脂醇提液毒性明显大于水煎液，续断水煎液的毒性明显大于醇提液。其中有的药味毒性已引起重视，但现有研究尚不够深入，如补骨脂、淫羊藿、乳香、没药、木香和独活[2，13-21]，续断的毒性尚未见报道，有待进一步研究。另发现鸡血藤和狗脊醇提液毒性较大，而水煎液则安全性好；桑寄生、熟地黄和骨碎补的醇提液和水煎液的安全性均较好。

本实验用斑马鱼全面考查了壮骨关节丸中12种药味安全性，其中乳香、没药常配对入药合并为一种，其它药味均单独测试，考虑到部分药味打粉入药[23]，每种药味均设水煎液和醇提液组，并分别设5-8个剂量浓度，样本量大，难于用大鼠和狗高效评价，而斑马鱼毒性模型可在微板中实验，实时动态观察，实现高灵敏、低成本、高效率、规模化筛选，为快速发现复杂中药毒性根源提供了有力支撑和有益参考。

1 国家食品药品监督管理总局.警惕仙灵骨葆口服制剂引起的肝损伤风险.药物不良反应信息通报（第72期），http://www.sda.gov.cn/ WS01/CL0078/167184.html.

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21 段志文，张玉敏，李海山，等. 独活胶囊急性及长期毒性研究. 沈阳医学院学报,2002,4(1)：4-9,27.

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Efficient Screen of Toxic Herbal Medicine in Zhuang Gu Guan Jie Pill Based on Zebrafish Model

Chen Ying1,2, Wang Mo3, Jing Lijun1,2, Zhang Ning1,2, Chen Shuqin1,2, Wei Yingjie1,2
(1. The Third Clinical School of Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210028, China; 2. Key Laboratory of New Drug Delivery System of Chinese Materia Medica, Jiangsu Provincial Academy of Chinese Medicine, Nanjing 210028, China; 3. The Chinese People's Liberation Army (PLA) 93038 Army Hospital, Tonghua 135300, China)

This study aimed at efficiently screening out the toxic herbal medicines in Zhuang Gu Guan Jie pill (ZGGJ) based on the zebrafish model. Zebrafish embryos at 1 day post fertilization (dpf) were administered by ZGGJ and the water decoction (WD) and ethanol extract (EE) of 12 herbal drugs in it with various concentrations. The number of embryo deaths after the administration was recorded at 2-6 dpf and 2-8 dpf， respectively. Embryonic micro-morphology of zebrafish (3 dpf) was observed， LC50value at 6 dpf was calculated by SPSS16.0. As a result， both the WD and EE of ZGGJ， fructus psoraleae， radix dipsaci， olibanum， myrrh， radix angelicae pubescentis and aucklandiae radix， and the EE of Caulis Spatholobo and Rhizoma Cibotii presented high organ toxicity to the juvenile zebrafish， featuring yolk sac swelling， deforming， blackening， indicating hepatotoxicity in the zebrafish. Their LC50value at 6 dpf was from 33.2 μg·mL-1to 392.7 μg·mL-1(LD50value was converted to crude drug. The same bellow.). The WD and EE of Epimedii Folium at 1，500 μg·mL-1led to yolk sac swelling and blackening. The LC50at 6 dpf varied at 1，100-1，350 μg·mL-1， showing a certain toxicity of Epimedii Folium. The WD of Caulis Spatholobo and Cibotii Rhizoma and both WD and EE of Rhizoma drynariae， taxilli herba and prepared rehmanniae radix didn’t change the toxicity to the organs in zebrafish. LC50value were over 1，500 μg·mL-1， presenting favorable safety. In conclusion， it was demonstrated that the zebrafish model efficiently identified the toxicity of different herbal medicines from ZGGJ and efficiently screened out the potential toxicants in vivo with the advantages of real-time， dynamic and large scale for traditional Chinese medical compounds.

Zhuang Gu Guan Jie pill， zebrafish， toxicity of herbal medicine， hepatotoxicity

10.11842/wst.2017.01.020

R285.5

A

（责任编辑：马雅静，责任译审：朱黎婷）

2016-12-23

修回日期：2017-01-13

＊ 国家自然科学基金委面上项目（81573833）：基于三维M-Act/Tox协同评价的抗骨质疏松中药筛选新方法的建立与应用，负责人：韦英杰；江苏省科技厅自然科学基金面上项目（BK20141507）：基于斑马鱼M-Act/Tox一体化评价的中药抗骨质疏松筛选新方法与应用，负责人：韦英杰；江苏省人才工作领导小组办公室2014年度江苏省第四期“333工程”科研资助项目（RA2014348）：基于斑马鱼毒/效同步评价的抗骨质疏松筛选中药新技术与应用，负责人：韦英杰；江苏省人力资源和社会保障厅江苏省第十批“六大人才高峰”（2013-YY006）：以二维斑马鱼模型联合色谱联用技术高效筛选中药抗骨质疏松体内外活性成分，负责人：韦英杰。

＊＊ 通讯作者：韦英杰，博士，研究员，硕士生导师，主要研究方向：中药物质基础与质量控制研究。