何强亮 刘元献 杨龙 吴新风 连纯利 胡镇 刘媛媛 熊雅岚

慢性咽炎动物模型的建立及相关指标观察分析*

何强亮2刘元献1杨龙1吴新风3连纯利1胡镇2刘媛媛2熊雅岚2

目的 采用化学刺激法建立慢性咽炎动物模型，评价各指标与模型间的相关性。方法16只新西兰兔随机分为两组，模型组在第1～15天予2.5%氨水喷咽，第8天于咽部注射松节油处理；空白组在第1～15天予蒸馏水局部处理。期间，观察比较两组动物行为学及体重变化。第16天，所有动物均从耳静脉抽取血标本，然后用空气注射法处死动物，立即取咽黏膜供病理组织学观察。结果模型组行为学、病理形态学指标造模前后变化明显，体重变化值具有统计学意义（P＜0.05），空白组各项指标无明显变化。两组血液各项生化指标差异比较无统计学意义（P＞0.05）。结论化学刺激法成功建立了慢性咽炎动物模型，行为学、体重及病理形态学指标评价模型有一定参考价值。

慢性咽炎；动物模型；制备方法；评价指标

慢性咽炎为咽部黏膜、黏膜下及其淋巴组织的慢性炎症。弥漫性炎症常为上呼吸道慢性炎症的一部分；局限性炎症则多为咽淋巴组织的炎症；临床上主要表现为咽部不适感（异物感、灼热感、刺激感等），时有咽痒、咳嗽等，是一种常见病、多发病[1]。目前，对于慢性咽炎动物模型的评价指标的报道较少，缺乏规范性，结合临床实际，考虑研究经费等因素，笔者通过研究观察分析两组动物模型在行为学、血生化及病理形态学指标的变化，明确其对评价慢性咽炎动物模型的价值。

实验过程

1 材料准备

普通级雌性新西兰兔16只,体重2.0～2.5kg（广东省医学实验动物中心提供），25%～28%氨水（济宁宏明化学试剂有限公司），蒸馏水（郑州津北化工有限公司），25%～27%松节油（无锡市展望化工试剂有限公司，批号：150601）。

喉头喷雾器（江苏平安有限公司），XD-300冷光源（南京亚南特种照明电器厂）、0°硬性鼻内镜（日本制造BX43型生物显微镜），电子称（广东香山衡器集团有限公司）等。

2 实验步骤

2.1 分组及处理

随机将16只新西兰兔平均分为两组，模型组[2]：第1～15天，在兔子咽部喷以浓度为2.5%氨水，分上、下午各1次，每次3掀，第8天在其咽部注射0.5ml的松节油,第16天取于兔子耳部抽取静脉血收集血样本，再以空气注射的方式处死并立即取下咽部黏膜及其组织作切片供病理观察。空白组：第1～15天，在兔子咽部喷以蒸馏水，分上、下午各1次，每次3掀，第16天处理同模型组。

2.2 指标观察

2.2.1 一般情况

通过观察兔子口部抓痕情况，喷喉后半小时饮水情况，口咽部分泌物量的情况及每天的食量变化来评价兔子的精神状态，于第15天在硬性鼻内镜下观察造模组兔子的咽部黏膜情况。

2.2.2 血生化及病理形态学

在实验第16天，于兔子耳缘静脉处采用一次性采血针收取血样本，分别置于血常规及肝肾功能试剂管中，存放于保温箱中后立即送至广东省医学动物实验中心检测样本指标的变化情况；用10%甲醛溶液固定取出的咽部黏膜及其组织，经专业人员处理后，通过光学显微镜，观察两组兔子咽部组织各层的病理形态变化（由广东省医学实验动物中心比较医学实验室承担）。

3 统计学处理

实验结果

1 一般情况

模型组：兔子整体精神状态变化明显；前7天，兔子整体的精神状态较好，与空白组无明显差异，但每次喷完氨水后，饮水量及频次明显增多，食量未见明显变化，口腔可见少量分泌物；在注射松节油处理后，兔子整体精神状态发生明显变化，自主活动减少，表情淡漠，搔抓口部频繁，饮水量及频次明显下降，食量明显减少，口腔分泌物逐渐增多；松节油处理后的第4天各项情况表现最明显，部分兔子口腔分泌物粘稠。第15天，通过硬性鼻内镜，观察到兔子咽部黏膜呈暗红色，光泽度欠佳，黏膜分泌物增多。

空白组：兔子整体精神状态未发生明显改变，实验第1～15天，兔子整体精神状态良好，自主活动正常，无搔抓口部等动作，饮水、食量前后无变化。第15天，通过硬性鼻内镜，观察到兔子咽部黏膜淡红、湿润，表面光滑，无明显充血、肿胀。

通过对比模型组兔子体重前后改变明显，数据结果显示模型组差异有统计学意义（P＜0.05），空白组兔子体重前后无明显改变（P＞0.05）如表1。

表1 两组兔子体重的对比（）

2 血生化指标

两组兔子血常规结果中均有部分兔子各项指标接近正常、部分兔子结果中白细胞、中性粒细胞等高于正常值；两组结果统计学检测无明显差异（P＞0.05），见表2；两组兔子肝、肾功能结果基本均在正常值范围，无明显统计学差异（P＞0.05），见表3。

表2 两组兔子的血常规指标比较（）

表3 两组兔子的肝、肾功能指标比较（）

3 病理表现

空白组：通过显微镜观察，可见咽部组织各层分界清晰，由外到内可见，黏膜下层为疏松结缔组织，内含丰富的腺体，腺体无增生和萎缩，黏膜层中的上皮层为未角化复层扁平上皮，固有层为致密结缔组织，内含少量血管，可见分泌腺导管（图1）。

图1 空白组

讨论

慢性咽炎发病率高，病程长，易反复，难治愈，发病率占到咽喉部疾病的10%～12%，占耳鼻咽喉疾病的1%～4%；病毒、细菌感染及理化刺激等均可致病；其症状多种多样，主要为咽不适感，咯痰、咳嗽等，影响患者的工作和生活，严重者可导致心理障碍,特别是抑郁、焦虑尤为突出[1]。目前，关于慢性咽炎的研究大多集中在临床观察等领域，对于相关的动物实验等基础研究较少；另一方面，对于慢性咽炎的诊断及治疗，尚缺乏有效的药物及治疗方法，尤其在检测手段上，相关文献较少，且尚无明确统一的检测标准。为此，开展慢性咽炎动物模型的相关研究是非常有必要的，通过动物建模的建立及相关指标的分析，明确这些指标与模型间的相关性，为后期实验提供必要的数据支持。

在此之前，最早有成都中医药大学彭顺林教授团队开展的慢性咽炎动物模型及病理学的研究，为慢性咽炎的建模提供了理论依据[2]；之后，深圳市中医院刘元献教授在此基础上开展了中药喷喉治疗慢性咽炎动物模型的研究[3]，进一步拓展了此领域的研究。但在模型的指标的评价及标准，尚未在医学领域达成统一的共识，为此进一步开展相关的基础研究十分有必要。

模型组：通过显微镜观察，可见咽部黏膜上皮呈钉状突增生，部分上皮脱落、坏死，黏膜下层和固有层黏膜水肿，炎性细胞浸润明显，其中主要以淋巴细胞、嗜酸性粒细胞为主，部分小血管增生扩张，黏膜下层内黏液腺分泌活跃（图2）。

图2 模型组

炎症根据病因可分为感染性炎症、非特异性炎症及变态反应性炎症，慢性咽炎属于非特异性炎症。因此，在确立观察指标上，我们依据非特异性炎症反应的3个时相（即以局部血管扩张、毛细血管通透性增加为特征的急性时相；以白细胞、巨噬细胞浸润为特征的亚急性时相；以组织变性和纤维化为特征的慢性增殖相），以期确立了慢性咽炎动物模型相关评价指标，更加系统化、规范化；同时，在观察方法上，我们采用临床使用的硬性鼻内镜直接观察咽部情况，更加接近临床，为本实验的一大亮点。在查阅近20年相关资料，慢性咽炎实验动物多为大鼠及兔子，造模方法主要有氨水直接喷雾法、氨水定点定量涂抹法、氨水+松节油法等以化学物质刺激致炎。参考以往的实验研究，我们选取兔子作为实验对象，采取氨水+松节油化学物质刺激的方法确保了实验的可行性。

根据咽炎的发病机制，通常在化学刺激的一周内会产生急性咽炎的表现，如不加以干涉，部分兔子会在一周内自行恢复正常，因此我们将造模时间确定在2周，反复刺激确保慢性咽炎模型的成功。急性期（通常1周内）可见：黏液分泌逐渐增多、咽部黏膜充血、肿胀呈鲜红色等现象；咽部组织炎性变化明显，黏膜下弥漫性炎症细胞浸润、局部溃疡、鳞状上皮明显增生。之后反复刺激，进展成为慢性咽炎，可见咽部黏膜炎性细胞浸润、水肿，上皮层发生轻度增生性改变，钉状突延长，固有膜内见散在弥漫性炎细胞浸润，血管扩张明显，黏膜下层内黏液腺分泌较多，浆内含大量分泌颗粒[4]。

笔者通过实验观察发现，与体积小、敏感性强的大鼠比较，具有体积大、性格温顺等优点的兔子模型在日常管理、标本采集及病理形态改变等方面，都优于以往的大鼠模型。经有效化学刺激使之产生炎症，炎症反应会产生一系列的炎症因子，模型组兔子在行为学方面产生一系列的改变：体重减轻，饮水量、自发活动、搔抓口部活动、口腔分泌物均明显增多，与空白组产生对照；病理学表现为咽部黏膜上皮呈钉状突增生，部分上皮脱落、坏死，黏膜下层和固有层黏膜水肿，炎性细胞浸润明显，其中主要以淋巴细胞、嗜酸性粒细胞为主，部分小血管增生扩张，黏膜下层内黏液腺分泌活跃，这些阳性指征对于评价造模的成功具有参考价值。从血生化结果分析，两组兔子在血常规及肝、肾功能结果无明显差异，对于临床诊断无明显参考意义，这可能与慢性咽炎的发病机制及个体自身免疫功能相关[5]，在炎症刺激的急性期及亚急性期，主要改变表现为局部血管扩张、毛细血管通透性改变；同时血液中白细胞等炎细胞浸润为主，肝功能无明显变化[6]，反复刺激后发展成为慢性炎症，加之自身的免疫机制，血液学改边恢复正常，具有一定的自限性。

本研究依据慢性咽炎的发病机制，以期确定评价慢性咽炎动物模型相关指标，结合临床内镜观察发现：在慢性咽炎动物模型研究中，行为学、体重及病理学形态学相关指标具有一定的参考价值；相关血生化结果（血常规、肝肾功能）无明显差异性，进一步明确了相关实验数据的价值，为后期药物实验提供可靠的实验模型及有效的数据支撑。

1 黄兆选,等.实用耳鼻咽喉头颈外科学[M].2版.北京：人民卫生出版社,北京：2007:317-319.

2 彭顺林,钟渠,熊大经.慢性咽炎动物模型研究[J].成都中医药大学学报,1999,22(1):51-53.

3 刘元献,李许娜,吴新风,等.天竺雾化剂对慢性咽炎动物模型的行为学及病理形态学观察[J].中国中西医结合耳鼻咽喉科杂志,2016,24(3):164-167.

4 薛淑媛,朱丹,姚兴凤,等.急、慢性咽炎动物实验研究概况[J].北方药学,2016,13(10):121-122.

5 阮岩,陈蔚.清咽喷雾剂改善免疫功能的实验研究[J].中国中医基础医学杂志,2006,12(3):185-186.

6 梁璐,朴晋华,马建丽.急性和慢性咽炎的发病机制与动物模型建立的研究现状[J].临床医药实践,2012,21 (7)：540-543.

（收稿：2016-10-12 修回：2016-11-02）

Establishment of animalmodelw ith chronic pharyngitis and indexes analysis associated with model evaluation

HE Qiangliang，LIU Yuanxian,YANG Long,WU Xinfeng,LIAN Chunli,HU Zhen,LIU Yuanyuan,XIONG Yalan
Departmentof Otolaryngology,Shenzhen Municipal TCM Hospital Affiliated to Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangdong,518033,China

ObjectiveTo establish?an animalmodel of chronic pharyngitis?via chemical stimulus to investigate the correlation of associated indexes with the model evaluation based on an experimental study.MethodsSixteen New Zealand rabbits were randomly divided into two groups.Animals inmodel group(MG)were treated by 2.5%ammonia spraying into pharyngeal cavity from the first day to the fifteenth day,twice one day,and with turpentine oil injected into the submucous tissue of the pharynx by the 8th day,while those animals in blank group(BG)were treated only by distilled water sprayed into pharyngeal cavity in the same way. Then,observed comparatively were the changes in behavior and body weight during the whole experimental period.By the 16th day, blood sampleswere collected from auricular vein among all animals of the two groups through at first,and then,these rabbitswere put into death by air injection method to take tissue samples from pharyngeal mucosa for pathohistological observation.ResultsThe changes in the indexes of behavior and pathohistology were very significant among the animals of MG,when compared thosemeasured by the end of experimentwith thatbefore treating,particularly for that of body weight(P＜0.05).However,these indexes showed little changes among animals of BG,with no significantly statistical significance(P＞0.05).Moreover,no significant differences were seen in the changes of serum biochemical indexes in the two groups of animals during the whole period of experiment(P＞0.05).ConclusionAnimalmodel of chronic pharyngitis is successfully established?through chemical stimulus to pharyngealmucosa.Such indexes as changes taking place in behavior,body weight and pathohistology hold certain reference value for evaluating the effectiveness of the model.

Chronic pharyngitis;Animalmodel;Model establishingmethods;Effectiveness evaluating indexes

10.16542/j.cnki.issn.1007-4856.2017.01.005

广东省中医药管理局面上项目（20132025）

1 广州中医药大学附属深圳市中医院耳鼻咽喉科（）

2 广州中医药大学在读硕士研究生

3 深圳市罗湖区中医院耳鼻咽喉科

刘元献,主任医师.Email:Liuyx2011@126.com