王菲 尚展鹏++马志国++刘思燚 王子健 张加余

[摘要]该研究以川麦冬为研究对象，考察不同干燥方法对麦冬药材中化学成分的影响。取新鲜川麦冬块根粗粉，分别采用50 ℃烘干干燥、80 ℃烘干干燥、-70 ℃冷冻干燥3种方法进行干燥处理，应用HPLCDADELSDMSn多检测器串联技术，筛选鉴定干燥过程中变化显著的高异黄酮类和甾体皂苷类化学成分。结果显示：与新鲜麦冬药材的HPLC图相比，50 ℃烘干干燥最能保持药材固有化学成分；80 ℃烘干干燥、-70 ℃冷冻干燥方法则对化学成分影响较大；结合HPLCHRMSn数据，最终筛选了36个差异性成分，并鉴定了其中24个差异性成分（11个甾体皂苷和13个高异黄酮）的结构。结果表明，不同干燥方法对川麦冬中甾体皂苷和高异黄酮有明显影响；从成本、成分含量和实用性综合分析，50 ℃烘干干燥更有利于川麦冬药材中固有成分的保留，可以为川麦冬药材的产地干燥加工提供借鉴。

[关键词]川麦冬； 甾体皂苷； 高异黄酮； 干燥方法； HPLCUVELSDMSn

Influence of different drying methods on steroidal saponins and

homoisoflavonoids in Ophiopogon japonicus

WANG Fei1， SHANG Zhanpeng1， MA Zhiguo2， LIU Siyi1， WANG Zijian3， ZHANG Jiayu3*， LU Jianqiu4*

（1School of Chinese Pharmacy， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China；

2College of Pharmacy， Jinan University， Guangzhou 510632， China；

3Beijing Institution of Chinese Medicine， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China；

4Library of Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China）

[Abstract]To study the influence of three different drying methods （including 50 ℃drying， 80 ℃drying and -70 ℃freezedrying methods） on steroidal saponins and homoisoflavonoids in Ophiopogon japonicus，a HPLCDADELSDMSn method was investigated to screen and identify the differential components Through comparing the HPLC chromatograms with that of fresh O japonicus， 50 ℃drying medicine was similar with fresh medicine whereas the other two drying methods had great influence on the components of O japonicus In this study， 36 differential components were screened， among which 24 constituents（13 homoisoflavonoids and 11 steroidal saponins） were identified via HPLCLTQOrbitrap MSAs a result， it was revealed that different drying methods had significant influences on the components of steroidal saponins and homoisoflavonoids Among them， 50 ℃drying method was the most suitable drying approach when the stability of components， cost and practicability were considered

[Key words]Ophiopogon japonicus； steroidal saponins； homoisoflavonoids； drying methods； HPLCDADELSDMSn

doi：10.4268/cjcmm20162317

麥冬Ophiopogon japonicas （Lf） KerGawl为百合科植物麦冬的干燥块根，主产于四川、浙江等地，故有川麦冬和杭麦冬之分[1]。麦冬为常用滋阴中药，具有养阴生津、润肺清心之功效[2]。现代药理学研究表明，麦冬具有显著的耐缺氧、改善心血管、抗癌、降血糖等活性[35]。

药材产地干燥加工是中药生产与品质形成的重要环节，其间可能会发生成分相互转化[6]。2015年版《中国药典》中虽规定了麦冬的产地加工干燥方法，但未见具体干燥方法、干燥温度等详细参数[7]。目前，有文献报道不同干燥方法对麦冬品质的影响[810]，但仅局限于对特定主要活性成分的定量研究，并未系统研究差异性化学成分。因此，本研究应用HPLCDADELSDMSn多检测器串联技术，对不同干燥方法下川麦冬差异性甾体皂苷和高异黄酮类成分进行筛选鉴定，探讨不同干燥方法对药材中化学成分的影响，以期为川麦冬药材产地干燥加工提供科学依据。

1材料

川麦冬鲜品于2016年春季采于四川雅安，经北京中医药大学谭鹏副教授鉴定为百合科植物川麦冬O japonicus的新鲜块根。采收后，选择个体完整、色泽鲜艳的新鲜麦冬，除去须根，以清水洗去表面杂质，用保鲜塑料膜密封，置于冰箱内4 ℃低温保存。

高异黄酮类对照品（5，7，4′三羟基6甲基二氢高异黄酮、麦冬二氢高异黄酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B、5，7，2′三羟基4′甲氧基6，8二甲基二氢高异黄酮、麦冬二氢高异黄酮E）和甾体皂苷类对照品（ophiopojaponin C， 14hydroxysprengerinin C， ophiopogonin D′， ophiopogonin D， pennogenin 3O[αLrha（1→2）][βDxyl（1→4）]βDglc）均为本课题组前期从川麦冬药材中分离得到[1112]，其结构经1HNMR， 13CNMR等手段得以确定，经HPLC归一化法检测，纯度均≥95%。所用色谱级乙腈和甲醇均购于Fisher Scientific （Fair Lawn，USA），甲酸购于Sigma Aldrich （StLouis，USA），其余试剂均为分析纯。

Thermo Fisher DIONEX Ultimate 3000（德国Thermo公司），配有DAD检测器（德国Thermo公司）、ELSD 6000ES检测器（美国Alltech公司）、HPLCLTQOrbitrap XL质谱检测器（德国Thermo公司）；Xcalibur 21工作站（美国Thermo Scientific公司）；变色龙70工作站（美国Thermo Scientific公司）；R200D型电子分析天平（1/10万，德国Sartorius公司）；MilliQ Synthesis超纯水纯化系统（美国Millipore公司）；热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司）；冷冻干燥机（北京惠诚佳仪科技有限公司）等。

2方法

21不同干燥方法下的川麦冬样品制备

取新鲜川麦冬药材洗净擦干，混匀，称取3份，每份约20 g，分别进行50 ℃烘干、80 ℃烘干干燥和真空冷冻干燥（-70 ℃）。干燥指标：按照2015年版《中国药典》一部附录规定的水分测定，样品连续2次干燥后的质量差异在5 mg以下。①50 ℃烘干：将新鲜川麦冬药材均匀放在电热恒温干燥箱中，50 ℃鼓风干燥； ②80 ℃烘干：将新鲜川麦冬药材均匀放在电热恒温干燥箱中，80 ℃鼓风干燥； ③冷冻干燥：将新鲜川麦冬药材放入超低温冰箱中冷冻24 h，再放入冷冻干燥机中，真空度10 Pa，-70 ℃干燥。经准确称量计算后分别得到10021 1，9206 4，8013 2 g的干燥后药材，备用。

22不同干燥方法下川麦冬供试液及标准品溶液的制备

将干燥后的麦冬药材粉碎，分别称取步骤21项中各干燥品2459 3 g（50 ℃）， 2278 6 g（80 ℃）， 2012 1g（冻干）以及鲜品5014 4 g（注：各药材取样量按照干燥得率计算，误差均严格控制在1%以内，以消除取样误差对峰面积差异的影响），加70%甲醇25 mL，超声处理30 min，滤过，50 ℃水浴蒸至近干，加水2 mL使溶解，通过预平衡过的SPE（Solid Phase Extraction）固相萃取C18Low小柱（1667 g·L-150 pk，美国Grace公司），分别以2 mL水、2 mL甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，以022 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

分别取上述各对照品适量，精密称定，加甲醇溶解至01 g·L-1作为储备液，进样前适当稀释后使用。

23液相色谱条件

色谱柱ZorbaxSBAq C18色谱柱（46 mm×150 mm，35 μm）；流动相A 为01%甲酸水溶液，流动相B为乙腈甲醇（3∶1）；梯度洗脱：0～3 min，5%～10% B；3～6 min，10%～21% B；6～18 min，21%～26% B；18～40 min，26%～51% B；40～58 min，51%～55% B；58～60 min，55%～72% B；流速10 mL·min-1，柱温30 ℃，进样量5 μL，DAD检测波长296 nm；ELSD检测器：漂移管温度100 ℃，载气流速27 L·min-1。

24质谱条件

电喷雾离子源负离子检测模式，毛细管电压30 V，喷雾电压30 kV，毛细管温度350 ℃，鞘气30 arb，辅助气10 arb，CID碰撞能量35%。一级扫描分辨率为FWMH 3万；扫描范围为m/z 100～1 500。流动相采用柱后分流方式，进入DAD检测器和质谱检测器的流动相流速为030 mL·min-1，剩余的流动相进入ELSD检测器。

3结果与分析

31麦冬药材供试样品的提取方法优选

实验分别考察了提取溶剂、溶剂倍量以及提取时间对川麦冬中主要成分高异黄酮和甾体皂苷提取率的影响，最终确定以25 mL 70%甲醇超声提取30 min的供试样品溶液制备方法。

由于麦冬药材中含有大量的糖类成分，借助于SPE固相萃取不仅可以实现对选择性高的提取、分离、浓缩三位一体的过程，而且可以从供试样品中除去对麦冬固有成分分析有干扰的糖类物质。因此，本实验进一步采用SPE固相萃取法进行供试样品的制备，基于对糖的去除和目标成分的保留效果，最终优选了SPE固相萃取处理方法。

32不同干燥方法下川麦冬HPLCMS分析条件的优选

实验中分别考察了流动相种类、流速、柱温、洗脱梯度等对川麦冬中高异黄酮和甾体皂苷类成分的分离效果，得到不同干燥方法及鲜品川麦冬药材的HPLCDAD，HPLCELSD特征图谱，见图1，2。同时，优选了LTQOrbitrap高分辨质谱的分析条件，从而为后续的差异性成分结构鉴定提供依據。

33不同干燥方法下川麦冬药材差异色谱峰的筛选

川麦冬鲜品与各干燥品均平行测定3次，采用自动积分的方法分别对4种不同样品色谱图中的各色谱峰进行积分，并利用变色龙数据处理平台进行色谱峰面积归一化处理，根据各成分在检测器中的响应值，建立tRS（tR：保留时间；S：峰面积）数据集。每个保留时间tR下的色谱峰面积S取3次测定结果的平均值，以新鲜川麦冬药材中的色谱信息作为参照，计算峰面积差异率ω（%）。

ω=|Sx-Sy|/Sx×100%

Sx为tR下新品峰面积平均值；Sy为tR下干燥品峰面积平均值。

由此，筛选出ω≥10%的色谱峰，标注为差异色谱峰。结果，共筛选出36個差异色谱峰，其中HPLCDAD检测结果中有20个，见图1；HPLCELSD检测结果中有16个，见图2。

从上述特征图谱中可以发现，不同干燥方法对川麦冬固有成分有显著影响。无论是DAD还是ELSD检测结果，各干燥品在色谱峰数量和峰面积上有较大差异：与川麦冬鲜品相比，50 ℃烘干样品的色谱吸收峰数目与鲜品相当，且各吸收峰的峰面积也最为相近；80 ℃烘干干燥和-70 ℃冷冻干燥色谱吸收峰偏少，且峰面积与鲜品相比差异较大。这表明，在50 ℃烘干条件下川麦冬药材不仅能够较快地得以干燥，且不易发生固有化学成分的转化。

34相关差异性成分的HPLCLTQOrbitrap结构鉴定

甾体皂苷和高异黄酮类化合物是川麦冬的特征性成分，其基本裂解规律的相关研究已较为深入[1317]，可以为甾体皂苷和高异黄酮类差异性成分的结构鉴定提供借鉴。

341高异黄酮类化合物的结构鉴定通过查阅文献并结合对照品裂解方式发现，高异黄酮与普通黄酮类化合物裂解途径有显著的差别。高异黄酮类化合物一般有2条裂解途径： ①一般脱去B环+甲基，产生A环+C环的碎片信息。如化合物27，在负离子模式下，其准分子离子峰m/z 327086 5 [M-H]-（C18H15O6，误差04），在其二级质谱裂解过程中会脱去m/z 121，产生m/z 206 [M-H-C7H6O-CH3]-的碎片离子； ②只脱去B环，产生A环+C环+甲基的碎片信息。例如，化合物14，其准分子离子峰m/z 299092 5 [M-H]- （C17H15O5，误差26），在其进一步的二级质谱裂解过程中，能够产生m/z 203 [M-H-C6H7O]-的特征碎片离子。应用HPLCDADMSn技术，本研究从用不同干燥方法得到的麦冬药材中共鉴定了13个差异性高异黄酮类成分。其中，通过与对照品比对准确鉴定了6个化合物的结构，并结合保留时间、质谱裂解规律以及相关文献报道对其余7个化合物的结构进行了推测，见表1。

342甾体皂苷类化合物的结构鉴定甾体皂苷类化学成分是川麦冬的另一类特征性化学成分。在负离子模式下，甾体皂苷类成分的ESIMS 谱主要生成 [M-H]-及[M+HCOO]- 的准分子离子峰。

而它们的多级质谱裂解途径也非常相似，均表现为一系列糖残基（葡萄糖、鼠李糖、木糖、岩藻糖、阿拉伯糖等）的中性丢失，而且不同糖基的裂解顺序也不同。其中，对于糖链部分有乙酰基取代的化合物，其[M-H]-准分子离子峰在ESIMSn谱中会产生丢失乙烯酮基的特征碎片，此外还常能检测到[M-H-CH2CO-H2O]-的离子碎片。本研究应用HPLCELSDMSn从用不同干燥方法得到的川麦冬中共筛选了11个差异性甾体皂苷类成分。根据上述规律，通过与对照品比对保留时间以及多级质谱数据准确鉴定了5个甾体皂苷的结构，并对剩余的6个甾体皂苷类成分的结构进行了推断[1821]，见表1。

343其他未被鉴定的差异性成分本实验中有12个差异色谱峰未进行鉴定：有1个差异峰只有色谱信息，缺乏准确的质谱信息；7个差异峰虽然有质谱信息但未获得其多级信息；4个差异峰虽然色谱、质谱信息完整，但是未见文献报道，后续研究中将对这些成分进行研究。

4讨论

麦冬中的两大类特征性成分甾体皂苷和高异黄酮分别在ELSD和DAD检测器上有较好的响应，因此本研究建立了HPLCDADELSD多检测器串联的分析方法。例如，利用 DAD检测器进行全波长扫描分析，表明296 nm下高异黄酮类化学成分的色谱峰信息丰富且分离度良好；当ELSD检测器的漂移管温度为100 ℃，载气流速为27 L·min-1时，甾体皂苷类化学成分能够有较好的响应值。在此实验条件下，由于大部分色谱峰都可获得良好的分离度，可以实现以上两大类化学成分的同时定性和半定量分析。同时，HPLCLTQOrbitrap高分辨液质联用仪具有高分离度、高灵敏度和高选择性的优点，并能够提供精确的化合物相对分子质量信息，可以为本实验中麦冬差异性成分结构的鉴定提供有力的技术支撑。

本实验考察了50 ℃烘干干燥、80 ℃烘干干燥和-70 ℃冷冻干燥3 种方式对麦冬品质的影响。对比多检测器串联得到的色谱峰信息可以发现，不同的麦冬干燥方法对川麦冬固有化学成分有显著的影响。其中，50 ℃烘干干燥更有利于麦冬药材中化学成分的保留，可作为麦冬药材适宜的产地干燥加工方法。同时，根据高分辨质谱仪提供的碎片信息，从不同干燥方法得到的麦冬药材中筛选了36个差异性成分，并鉴定了24个差异性化合物，包括11个甾体皂苷和13个高异黄酮类成分。其中，川麦冬中甾体皂苷类在50 ℃烘干条件下损失的量要比80 ℃烘干干燥和-70 ℃冷冻干燥低，在采用80 ℃干燥时，该类成分的含量明显下降，变化率大多在25%以上，可能是由于皂苷类成分在高温下容易分解[2223]；而在-70 ℃冷冻干燥条件下，皂苷类成分也容易发生转变，与人参皂苷、栀子苷等化学成分的转变趋势基本一致[22，24]。另外，根据DAD结果还发现，发生转变的高异黄酮类成分主要为二氢高异黄酮，仅有1个高异黄酮（11号峰），可能与高异黄酮具有相对完整的共轭体系有关；当化合物结构中存在醛基时，在80 ℃烘干干燥和-70 ℃冷冻干燥条件下，化合物的稳定性较差，容易发生成分的转变（如：25号峰和36号峰）。

因此，本研究基本阐明了川麦冬在不同干燥过程中的甾体皂苷和高异黄酮类化学成分的变化，可为建立适宜的麦冬药材产地干燥加工方法提供科学依据。

[参考文献]

[1]王玉霞 麦冬药材质量评价及道地性初步研究[D] 北京：北京协和医学院， 2014

[2]马海波 麦冬化学成分的研究[D] 北京：北京中医药大学， 2013

[3]Tsai Y， Chiang S， Elshazly M， et al The oestrogenicand antiplatelet activities of dihydrobenzofuroisocoumarins and homoisoflavonoids from Liriope platyphylla roots [J]Food Chem， 2013， 140（1/2）：305

[4]Chen M H， Chen X J， Wang M， et al Ophiopogon japonicas——a phytochemical， ethnomedicinal and pharmacological review [J].J Ethnopharmacol， 2016， 181： 193

[5]TsaiY， Hsu C， Elshazly M， et al Phytochemicals and estrogenreceptor agonists from the aerial parts of Liriope platyphylla[J].Molecules， 2015， 20（4）：6844

[6]段金廒， 宿树兰， 吕洁丽， 等 药材产地加工传统经验与现代科学认识[J] 中国中药杂志， 2009， 34（24）：3151

[7]中国药典 一部[S] 2015： 26

[8]林冰， 齐美娜， 杨光辉， 等 不同干燥方式对麦冬品质的影响 [J] 山地农业生物学报， 2013（5）： 442

[9]吴发明， 张芳芳， 李敏， 等 川麦冬产地干燥方法综合评价研究 [J] 中药材， 2015（7）： 1400

[10]吴发明， 曾俊， 李敏， 等 基于药材性状特征和含量测定分析干燥温度对麦冬质量的影响 [J] 药物分析杂志， 2016（7）： 1310

[11]Li N， Zhang L， Zeng K W ， et al Cytotoxic steroidal saponins from Ophiopogon japonicas [J] Steroids， 2013， 78 （1）： 1

[12]Li N， Zhang J Y， Zeng K W， et al Antiinflammatory homoisoflavonoids from the tuberous roots of Ophiopogon japonicas [J] Fitoterapia， 2012， 83 （6）： 1042

[13]Ye M， Guo D A Analysis of homoisoflavonoids in Ophiopogon japonicas by HPLCDADESIMSn[J] J Am Soc Mass Spectrom， 2005， 16（2）：234

[14]Lin Y N， Zhu D N， Qi J， et al Characterization of homoisoflavonoids in different cultivation regions of Ophiopogon japonicas and related antioxidant activity[J] J Pharm Biomed， 2010， 52（5）： 757

[15]張加余， 乔延江， 高晓燕， 等 清火栀麦片中化学成分的SPEHPLCESIMSn快速识别与鉴定[J] 中国中药杂志， 2013， 38（2）：186

[16]Q J， Xu D R， Zhou Y F， et al New features on the fragmentation patterns of homoisoflavonoids in Ophiopogon japonicus by high performance liquid chromatography/diodearray detection/electrospray ionization with multistage tandem mass spectrometry[J]Rapid Commun Mass Spectrom， 2010， 24（15）：2193

[17]郭哲， 陈丽， 梁琼麟， 等 基于准确相对分子质量和多级质谱技术的LCMS方法鉴定麦冬醇提液中高异黄酮类成分[J]. 中草药， 2011， 42（5）：844

[18]李宁麦冬化学成分研究[D]北京：北京大学， 2011

[19]Wang Y Y， Xu J Z， Qu H B， et al Structure characterization and identification steroidal saponins from Ophiopogon japonicas KerGawler （Liliaceae） by highperformance liquid chromatography with ion trap mass spectrometry[J] Phytochem Anal， 2011， 22（2）： 166

[20]Xie T， Liang Y， Hao H， et al Rapid identification of ophiopogonins and ophiopogonones in Ophiopogon japonicus extract with a practical technique of mass defect filtering based on high resolution mass spectrometry[J] J Chromatogr A， 2012， 1227（5）：234

[21]Zhu J B， Guo X J， Fu S P， et al Characterization of steroidal saponins in crude extracts from Dioscorea zingiberensis C.H Wright by ultraperformance liquid chromatography/electrospray ionization quadrupole timeofflight tandem mass spectrometry[J]. J Pharm Biomed Anal， 2010， 53（3）：462

[22]李芳， 李乔， 宋丹， 等 不同干燥方法对人参花和西洋参花皂苷类成分的影响 [J] 中草药， 2015， 46（19）： 2937

[23]宗洁， 张仲欣， 李叶贝， 等 柴胡中皂苷损失率的干燥工艺优化研究 [J] 山东化工， 2015， 44（2）： 10

[24]赵璨，张浩，陈阳，等 不同干燥方法对栀子药材中两种化学成分含量的影响[J] 华西药学杂志，2009， 24（2）： 149

[25]王子健， 刘颖， 刘思燚， 等 UPLCHRMSn结合高能诱导裂解快速鉴定麦冬中高异黄酮类成分 [J] 质谱学报，2016，doi： 107538/zpxbyouxian20160043

[责任编辑丁广治]