李春 苏晓 冯伟红 李娆娆 刘晓谦 李鹏跃 王智民

[摘要]通過测定何首乌中多种真菌毒素的含量，探讨其致肝毒性原因。采用高效液相色谱串联质谱法检测何首乌中黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2，赭曲霉毒素A，B，T2毒素，HT2毒素，伏马毒素B1，B2，玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇共12种真菌毒素的含量。样品采用改良的QuEChERS方法提取，使用WelchUltimate XBC18色谱柱（46 mm×100 mm，25 μm）分离，甲醇含01%乙酸的2 mmol·L-1醋酸铵水溶液为流动相梯度洗脱，多反应监测模式下测定，外标法定量。结果表明，12种真菌毒素在01～200 μg·kg-1线性关系良好，相关系数为 0996 3～0999 9，加标回收率为 7119%～9868%，相对标准偏差为17%～13%。该方法操作简单、准确、灵敏，可用于何首乌中多种真菌毒素的快速测定。结果显示，41批样品中的15批检出了真菌毒素，涉及毒素类型有AFB1，AFG2，FB1，OTB，T2，HT2，FB2和OTA共8种，毒素在051～1 6432 μg·kg-1。其中1批制首乌中检测到AFB1，达68 μg·kg-1，超出了其在2015年版《中国药典》中的限量标准（5 μg·kg-1）。AFB1具有明确的肝毒性。因此，推测何首乌在产地加工、储存运输过程中产生的少量霉变样品是其导致肝损伤的重要因素之一。

[关键词]何首乌； 肝毒性； 真菌毒素； 液相色谱串联质谱法； QuEChERS

Simultaneous determination of 12 mycotoxins in Polygoni Multiflori Radix by UPLCESIMS/MS combined with modified QuEChERS

LI Chun1，2， SU Xiao1，2，3， FENG Weihong1，2， LI Raorao1，2， LIU Xiaoqian1，2， LI Pengyue1， WANG Zhimin1，2*

（1 Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China；

2 National Engineering Laboratory for Quality Control Technology of Chinese Herbal Medicines， Beijing 100700， China；

3Tianjin University of Chinese Medicine， Tianjin 300100， China）

[Abstract]To investigate the cause of liver toxicity induced by Polygoni Multiflori Radix through determining various mycotoxins in it An UPLCESIMS/MS method was developed and established to simultaneously determine 12 mycotoxins， Aflatoxins B1， B2， G1， G2， Ochratoxins A and B， Fumonisins B1 and B2，T2 toxin， HT2 toxin， Deoxynivalenol and Zearalenone， in rawand processed Polygon iMultiflori Radix The sample was extracted with modified QuEChERS method， and then was separatedon a Welc

hUltimate XBC18 column by gradient elution using methanol and 2 mmol·L-1 ammonium acetate aqueous solution containing 01% acetic acidas mobile phase The analytes were detected in MRM mode by mass spectrometry and determined by external standard method This method made a good linearity in the 01200 μg·kg-1 with correlation coefficients of 0996 30999 9 The average recoveries of 12 mycotoxins at three spiked concentration levels were ranged from 7119% to 9868% with relative standard deviations of 17%13%. This method is simple， sensitive， accurate and suitable for the quantification of 12 mycotoxins in Polygoni Multiflori RadixAs a result， 15 batches were found fungus contamination and total 8 kinds of mycotoxins including AFB1， AFG2， FB1， OTB， T2， HT2， FB2 and OTA were detected， and their contentswere between 0511 6432 μg·kg-1 Among these contaminated samples， AFB1 was detected in one batch of processed Polygoni Multiflori Radix with the content of 68 μg·kg-1 beyond its limit standard 5 μg·kg-1 Since AFB1 has clear liver toxicity， we deduced that the mouldy samples may be one of the important causes of Polygoni Multiflori Radix causing liver toxicity

[Key words]Polygoni Multiflori Radix； hepatotoxicity； mycotoxins； ultraperformance liquid chromatography tandem mass spectrometry； QuEChERS

doi：10.4268/cjcmm20162313

何首乌为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb 的干燥块根，始载于《开宝本草》，上千年来一直作为补益药物广泛应用于临床，现在更是大量用于药品、保健食品、洗护发用品及食疗保健中。近年来何首乌肝损伤问题引起国内外的高度关注，也引发了国内外学者关于其肝损伤真实性及其肝毒性物质基础的研究热潮。针对何首乌肝损伤问题，许多学者采用常规毒理学方法进行研究，虽然因动物种属、药材来源、实验设计方案之不同而有所差异，但结果均表明何首乌在临床剂量下使用是安全无毒的，只有在超大剂量长期使用时才表现出一定的毒性[110]。针对其肝毒性物质基础，先后有“蒽醌致毒”[1114]、“二苯乙烯苷致毒”[1516]、“鞣质致毒”[15]等推测，但研究结果多为推测，至今尚无定论。笔者前期也曾考察了何首乌中11个蒽醌类成分的肝毒性，结果发现何首乌中所含的微量的蒽醌类成分并不足以导致其肝损伤[17]。那么，其肝损伤是不是由外在污染引起的呢？

研究中发现新鲜何首乌块/片或何首乌个子货放置在通风处摊晾，1 d后许多样品上就有发霉斑点产生。在药材市场购买何首乌时，许多商家也提到何首乌容易发霉长斑之问题。临床医生也反映临床上见到有些何首乌片外观漂亮但掰断后内部发黑质量堪忧。在百度中输入关键词“发霉何首乌”后可得到十几万个词条。这些现象提示何首乌的霉变是较普遍存在的事实。既然有霉变就有可能产生真菌毒素。近年来，陆续有从何首乌中检测到真菌毒素的报道，郭丽敏等[18]在制何首乌中检测到黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2，总含量在 20～25 μg·kg-1；Zheng H等[19]在何首乌中检测到黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素B和T2毒素等9种真菌毒素，总含量在 43～300 μg·kg-1。许多真菌毒素具有明确的肝毒性，那么何首乌的肝毒性是不是由霉变样品产生的真菌毒素导致的呢？为此，本文拟采用改良的QuEChERS（quick，easy，cheap，effective，rugged，safe）方法对何首乌样品进行前处理，并通过UPLCESIMS/MS技术检测何首乌中12种真菌毒素的含量，以考察何首乌中真菌毒素的污染水平并从外在污染方面探讨何首乌致肝毒性的原因。

1材料

超高效液相色谱串联质谱仪（美国 Agilent 公司，包括Agilent 1200高效液相色谱仪，Agilent 6410B三重四级杆串联质谱，电喷雾离子源）。氮吹干燥仪（NEVAPTM112，美国，Organomation Associates，Inc公司），1/10万分析天平（BAS1234SCW，德国，Sartorius 公司），高速离心机（Multifuge X1R，美国，Thermo公司），涡旋仪（WH2，中国，上海沪西公司），超声波清洗器（KQ250DB，中国，昆山市超声仪器有限公司）。

甲醇和乙腈（Fisher 公司，HPLC级），实验用水为屈臣氏纯净水。醋酸铵（质谱级，美国，Fisher 公司），乙酸（优级纯，国药集团化学试剂有限公司）；无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸三钠均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）；柠檬酸二钠为分析纯（阿法埃莎中国化学有限公司）。

黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2（批号分别为025M4092V，025M4138V，055M4047V，114M4032V，簡称AFB1，AFB2，AFG1，AFG2），伏马毒素B1和B2（批号分别为F1147，F3771，简称FB1，FB2），以上6种毒素均购自美国Sigma 公司。赭曲霉毒素A（Pribolab公司，批号1500427，100 mg·L-1，简称OTA），赭曲霉毒素B（Pribolab公司，批号1500414，10 mg·L-1，简称OTB），T2毒素（Pribolab公司，批号1500807，100 mg·L-1），HT2毒素（Pribolab公司，批号1500423，100 mg·L-1），脱氧雪腐镰刀菌烯醇（美国Supelco公司，批号XA15101V，200 mg·L-1，简称DON），玉米赤霉烯酮（美国 Sigma 公司，批号 SZEF021XV，100 mg·L-1，简称ZEN）。

41批何首乌样品信息见表1，经中国中医科学院中药研究所李娆娆副研究员鉴定为何首乌 P. multiflorum的干燥块根或其炮制品。

2方法与结果

21分析条件

色谱条件 Welch Ultimate XBC18色谱柱（46 mm×100 mm，25 μm）；流动相为甲醇（A）含01%乙酸的2 mmol·L-1醋酸铵水溶液（B），梯度洗脱（0～2 min，20%A；2～5 min，20%～60%A；5～10 min，60%～80%A；10～15 min，80%A；15～20 min，80%～95%A），流速 03 mL·min-1，柱温30 ℃，进样量 5 μL。

质谱条件离子源：电喷雾离子源；检测方式：多反应监测（MRM）；毛细管电压：40 kV；雾化气流速：100 L·min-1；脱溶剂气流速：300 L·min-1；脱溶剂管温度：325 ℃；加热模块温度：325 ℃。采集模式、监测离子对（m/z）和其他参数见表2。

22混合对照品溶液的制备

各精密称取黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2和伏马毒素B1对照品适量，分别置10 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制成100 mg·L-1的单标储备溶液，于-20 ℃冰箱中保存，备用。精密称取伏马毒素B2适量置10 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制成质量浓度为40 mg·L-1的储备液，于-20 ℃冰箱中保存，备用。

各精密量取黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2储备液100 μL置同一10 mL棕色量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，得质量浓度为1 mg·L-1的黄曲霉毒素工作液。

精密量取赭曲霉毒素B标准液（10 mg·L-1）05 mL至5 mL量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，得质量浓度为1 mg·L-1的工作液。

精密量取脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准液（200 mg·L-1）05 mL至10 mL量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，得质量浓度为10 mg·L-1的工作液。

精密量取玉米赤霉烯醇标准液（100 mg·L-1）1 mL至10 mL量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，得质量浓度为10 mg·L-1的工作液。

分别精密吸取取黄曲霉毒素工作液1 mL、伏马毒素B1储备液100 μL、伏马毒素B2工作液250 μL、赭曲霉毒素A标准液50 μL、赭曲霉毒素B工作液1 mL、T2标准液50 μL 、HT2标准液100 μL、脱氧雪腐镰刀菌烯醇工作液1 mL、玉米赤霉烯醇工作液1 mL 置同一10 mL棕色量瓶中，加甲醇定容至刻度，配制成每mL含AFB1，AFB2，AFG1，AFG2，OTB各100 ng，T2和OTA各500 ng，DON，HT2，FB1，FB2和ZEN各1 μg的12种真菌毒素混合对照品溶液，置-20 ℃冰箱中保存，备用。

23供试品溶液的制备

取何首乌药材粉末（过40目筛）20 g，精密称定，置50 mL离心管中，精密加入4 mL纯净水，涡旋30 s，再精密加入1%的乙酸乙腈溶液10 mL，密闭，超声（250 W，40 kHz）提取30 min，期间振荡2次，取出，再分别精密加入40 g无水硫酸镁，10 g氯化钠，10 g柠檬酸三钠，05 g柠檬酸二钠，涡旋振荡2 min，以4 500 r·min-1离心10 min，精密取上清液 5 mL，于40 ℃水浴中氮气流吹干，用1 mL流动相（起始比例）复溶，涡旋混匀后过022 μm 微孔滤膜，即得。

24方法学验证

241专属性试验在21的色谱质谱条件下，12 种真菌毒素的MRM色谱图见图1。从图可知，12种真菌毒素分离良好，而空白基质加标样品的分析表明基质成分不干扰待测真菌毒素的检测。

242线性关系及定量限选取不含真菌毒素的何首乌作为阴性样品，按23项下方法制备空白基质溶液，添加不同量的真菌毒素混合对照品制作基质加标标准曲线，以待测真菌毒素色谱峰峰面积为纵坐标，質量浓度（μg·kg-1）为横坐标进行线性回归。以3倍信噪比作为检出限，10倍信噪比作为定量限。线性范围、回归方程及相关系数等参数见表3。

243加样回收试验分别精密吸取22项下的混合对照品溶液40，100，200 μL，各平行6份，置50 mL离心管中，氮气流吹干后，取何首乌阴性样品（No11）约20 g，精密称定，按23项下方法制备供试品溶液A。按21项下方法进行试验，测定各真菌毒素的峰面积（A）。

取何首乌阴性样品（No11）约20 g，精密称定，按23项下方法进行操作，至“精密取上清液 5 mL”，此时分别加入22项下的混合对照品溶液20，

50，100 μL，每个加入量各平行6份，其余操作同23项下，制备供试品溶液B。照21项下方法进行试验，测定各真菌毒素的峰面积（B）。

提取回收率以峰面积A/B进行计算。12种真菌毒素的提取回收率为7119%～9868%，相对标准偏差为17%～13%，结果见表3。

25样品分析

取生、制何首乌样品共41份，按上述方法测定，结果显示41批何首乌中的15批检出了真菌毒素，污染率达37%；检出的真菌毒素有AFB1，FB2，OTA，AFG2，OTB，HT2，T2和FB1共8种。其中购自河南焦作的制首乌样品（No37）中检测到AFB1，达68 μg·kg-1，超出了2015年版《中国药典》中AFB1的限量标准。共有11批样品中检测到FB2，其污染率高达314 %，其中7号样品中的FB2高达1 6432 μg·kg-1，超过了欧盟规定的玉米淀粉中FB2的限量标准1 000 μg·kg-1[20]。外观有明显霉变的样品（No1～7）中均检测到2～5种真菌毒素不等，而外观正常的34份样品中有8份检测到真菌毒素。结果见表4。

3讨论

31方法优化

液质联用分析流动相选择需要同时兼顾物质分离和离子化效率。本研究曾采用乙腈水、甲醇水、甲醇01%甲酸水、甲醇01%乙酸水、甲醇含01%乙酸的2 mmol·L-1醋酸铵、甲醇含01%乙酸的5 mmol·L-1醋酸铵作为流动相组成，结果发现甲醇比乙腈具有更高的灵敏度和更好的峰形，因此选择甲醇作为流动相A。加入01%甲酸水或01%乙酸水后，各化合物电离程度加大，离子响应值提高，二者效果相当。当加入含01%乙酸的2 mmol·L-1醋酸铵后，各真菌毒素响应值均较单独使用01%乙酸水时提高，其中T2和HT2毒素响应值升高最明显，当醋酸铵浓度增大到5 mmol·L-1时，T2和HT2的响应值呈降低趋势，因此最终选择含01%乙酸的2 mmol·L-1醋酸铵作为流动相B。

参考文献[2123]方法，采用QuEChERS法进行样品前处理。期间优化了不同酸性乙腈（1%甲酸乙腈、1%乙酸乙腈、5%甲酸乙腈及5%乙酸乙腈）对真菌毒素的提取效率，结果显示1%乙酸乙腈的提取效率最高。传统Quechers方法需要在样品提取后加入C18和PSA等吸附剂除杂来净化样品，本实验曾比较了C18和PSA吸附剂的净化效果，结果发现净化处理后各毒素的回收率均低于提取后直接测定的回收率，而基线也未见明显改善，因此选择样品提取后直接测定，不予净化处理。

32霉变何首乌是否能导致肝损伤

黄曲霉毒素对人及动物肝组织有破坏，严重时可导致肝癌甚至死亡。2015年版《中国药典》中共有大枣、水蛭、莲子等19种中药项下和包括南五味子、麸炒薏苡仁等14种中药饮片项下制定了黄曲霉毒素的限量标准，其中AFB1的质量分数不得过5 μg·kg-1，AFB1，AFB2，AFG1和AFG2的总量不得

超过10 μg·kg-1。本次测定发现，购自河南焦作的制首乌（No37）中的AFB1达68 μg·kg-1，明显超出了其限量标准，而其表面看起来又很正常没有霉点产生，因此这批样品很可能会在市场上正常流通，如果某人正好服用了这批AFB1超标的何首乌则有可能发生肝损伤。此外，某些表面发霉的样品中虽然没有检测到剧毒的AFB1，但是检测到有多种真菌毒素共存，而共同存在的真菌毒素会产生毒性增强和协同的效果，这种毒性作用比单一毒素的总和要强烈，而且共存的真菌毒素会产生潜在的不能预测的毒性作用[2426]。因此，无论是患者正好服用了AFB1超标的某批何首乌样品，还是正好服用了有多种真菌毒素共存的样品后都有可能出现肝损伤。而且，尚有其他可能导致肝损伤的真菌毒素未被检测，其在何首乌中的污染水平不得而知。

综上，笔者推测何首乌霉变产生的真菌毒素是其导致肝损伤的重要原因之一。后续研究中，课题组将收集更多批次和来源的生、制何首乌样品进行真菌毒素检测，考察市场上何首乌出现真菌污染的几率，为制定其真菌毒素的限量标准提供依据。同时，课题组还将对何首乌中真菌毒素的产生条件和含量变化规律进行研究，为杜绝污染提高其用药安全奠定基础。

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[責任编辑孔晶晶]