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脑心通胶囊促进后下肢缺血损伤小鼠内皮祖细胞动员与归巢

2017-04-07邱丽珍陈璐李春晓耿潇尤星宇

中国中药杂志 2016年23期
关键词:归巢骨髓移植动员

邱丽珍++陈璐+李春晓+耿潇+尤星宇

[摘要]內皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)是一种能分化为血管内皮细胞的前体细胞,组织缺血缺氧所产生的信号分子可促使骨髓EPCs动员至外周循环,并归巢于损伤组织参与新生血管的形成。脑心通胶囊(Naoxintong capsule,NXT)具有活血化瘀、行气止痛之功效,其多成分具有血管保护作用,可以有效改善组织缺血症状,但其对EPCs动员和归巢的作用尚不明确。该研究采用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)转基因小鼠骨髓移植(bone marrow transplantation,BMT)联合后下肢缺血损伤模型(unilateral hind limb ischemia,UHLI)研究脑心通胶囊对EPCs动员和归巢的作用。受体小鼠经CS137全身照射后,从目内眦静脉丛输注GFP标记的骨髓单个核细胞,建立BMT模型,经过4 周骨髓重建后取外周血检测GFP阳性细胞比例。取BMT模型成功的小鼠,采用股动脉结扎复制UHLI模型,术后随机分为3组:模型组、NXT组(模型+NXT)和阳性对照组(模型+辛伐他汀)。采用流式细胞术检测骨髓重建4周后GFP阳性细胞比例,术前及术后第1,3,7,14 天外周血中EPCs细胞数;采用免疫荧光组织化学染色检测给药3,7 d缺血腓肠肌组织EPCs细胞归巢数目。BMT小鼠与 GFP 基因鼠相比, GFP 阳性细胞比例无显著性差异;术后1,3 d,NXT组和辛伐他汀组外周血EPCs数量显著性上调;术后 3,7 d,NXT组和辛伐他汀组EPCs归巢数量显著高于模型组(P<0001),因此脑心通胶囊能显著促进EPCs的动员与归巢。

[关键词]脑心通胶囊; 骨髓移植; 后下肢缺血损伤模型; 内皮祖细胞; 动员; 归巢

Effect of Naoxintong capsule on endothelial progenitor cell mobilization

and homing following bone marrow transplantation in a mouse

hind limb ischemia model

QIU Lizhen, CHEN Lu, LI Chunxiao, GENG Xiao, YOU Xingyu, ZHANG Lusha, WANG Hong*

(Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin State Key Laboratory of Modern

Chinese Medicinethe Ministry of Education to Build National Key Experimental Cultivation

Base, Tianjin StateKey Laboratory of Chinese Pharmacology, Tianjin State Key Laboratory of

Prescription Medicine of Ministry of Education, Tianjin 300193, China)

[Abstract]Endothelial progenitor cells (EPCs) are precursor cells of endothelial cells Signal molecules produced by ischemia and hypoxia can promote mobilization of bone marrow EPCs to peripheral circulation and formation of novel blood vessels in tissues that are damaged during heart attack Naoxintong capsule (NXT) has the functions of promoting blood circulation, removing blood stasis, promoting the circulation of qi and relieving pain The various components in NXT have protective effects on blood vessels and can effectively improve the symptoms of ischemia However, its effect on EPCs is not clear To study the intervention effect of NXT on mobilization and homing of peripheral blood EPCs, green fluorescent protein (GFP) transgenic mice were used for bone marrow transplantation (BMT) and then unilateral hind limb ischemia model (UHLI) were constructed For BMT, wildtype ICR mice were irradiated by CS137 and then injected with 4×106 bone marrow cells isolated from GFP mice The bone marrow reconstitution of recipients was assessed by quantification of GFP bone marrowderived cells (BMDC) from transplanted mice 4 weeks after BMT The UHLI model was duplicated by ligating femoral artery and divided into three groups: the model group, the NXT group (model+NXT) and the positive control group (model+simvastatin) Flow cytometry was used to detect the proportion of GFP positive cells and the peripheral blood EPCs levels at 1, 3, 7, 14 days before and after surgery Ischemic tissue of gastrocnemius muscle was excised at 3 and 7 days after operation for immunofluorescence staining to detect the number of GFP+ cells The bone marrow chimerism was achieved at day 28 after BMT There was no significant difference in the percentage of GFP positive cells between BMT mice and GFP transgenic mice NXT and simvastatin could significantly increase the number of peripheral blood EPCs 1,3 days after surgery Three and seven days after operation, the number of homing EPCs was significantly higher in NXT group and positive control group than that in model group (P<0001) In conclusion, NXT can obviously promote the mobilization and homing of EPCs

[Key words]Naoxintong capsule; bone marrow transplantation; hind limb ischemia model; endothelial progenitor cells; mobilization; homing

doi:10.4268/cjcmm20162320

缺血性血管疾病是目前威胁人类健康的重要疾病之一,其中下肢血管缺血性疾病以高发病率、高致残率和高死亡率成为仅次于缺血性脑卒中、冠心病之外危害人类健康的重大公共卫生问题[1]。由于损伤组织缺血缺氧,下肢缺血性疾病常表现为伤口愈合较慢、间歇性跛行,严重时甚至出现溃疡和坏疽[2],因此恢复缺血组织血流灌注,促进血管新生成为亟待解决的问题。其中内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)是一种能分化为血管内皮细胞的前体细胞,在血管新生中发挥着关键作用。组织缺血缺氧所产生的信号分子可动员骨髓EPCs至外周循环,并归巢于损伤组织参与新生血管的形成[34]。

中医学理论认为,下肢缺血性疾病具有“瘀血、缺血、血管狭窄或闭塞”等“血瘀证”特點[5]。脑心通胶囊(Naoxintong capsule,NXT)属于复方中药制剂,是结合“供血不足乃万病之源”中医学理论与现代人的病理特点,挑选黄芪、丹参、水蛭、地龙等16味植物药和虫类药精制而成。脑心通胶囊具有益气活血,化瘀通脉等功效,可用于气虚无力推动血液运行而导致的血瘀证,现代临床上广泛应用于心肌梗死和缺血性脑血管等缺血性疾病的预防和治疗[6],其多种成分具有血管保护作用,可以有效改善组织缺血症状,但其对EPCs的动员和归巢作用尚不明确。小鼠后下肢缺血损伤模型是研究缺血性疾病血管再生的经典模型,与临床上下肢动脉疾病症状类似。因此本实验采用小鼠单侧后肢股动脉缺血模型(unilateral hind limb ischemia,UHLI)联合GFP转基因小鼠骨髓移植(bone marrow transplant,BMT)模型,研究NXT对后肢缺血损伤小鼠内皮祖细胞动员和归巢的作用。GFP转基因小鼠能全身性稳定表达绿色荧光蛋白,在本实验中用作骨髓源性EPCs的示踪工具。

1材料

11动物60只SPF级健康雄性ICR小鼠,12只SPF级GFP(ICR)基因鼠,雌雄各半,体重28~32 g,8周龄,购于北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证号SCXK(京)20120001。实验动物于天津市中国医学科学院生物医学放射工程研究所动物房中分笼饲养,自由进食,饲养温度22~25 ℃,相对湿度40%~60%。

12药物与试剂脑心通超微粉(陕西步长制药有限公司);辛伐他汀(Sim)(杭州默沙东制药有限公司,批号L0233822)。avertin (美国Sigma公司);流式抗体PEFlk1,APCCy7Sca1(Becton,Dickinson and Company,货号分别为555308,560654);09%氯化钠注射液(山东科伦药业有限公司,批号13151203062);肝素钠 (江苏万邦生化医药股份有限公司,批号5150211);柠檬酸钠粉末,柠檬酸粉末 (天津市科密欧化学试剂有限公司);5% BSA封闭液 (SW3015100),DAPI溶液(即用型)(C0065),PBS粉末(P1010,2 L/袋),PBS缓冲液 (P1020500),抗荧光淬灭封片剂 (S210025),4%多聚甲醛 (p1100500),红细胞裂解液 (R1020500)均购于北京Solarbio科技有限公司;实验用水为去离子水。

13仪器体式显微镜LEICA S8APO(德国Leica);流式细胞仪(美国BD公司);Nikon倒置荧光显微镜(日本Nikon);低温高速离心机(美国BECKMAN,64R型);生物组织包埋机BMJ1(上海珂淮仪器有限公司);小动物手术器械包 (深圳市瑞沃德生命科技有限公司);小动物多功能麻醉机 (美国VETEQUIP,COMPAC5)。

2方法

21骨髓移植模型的建立参考文献方法建立骨髓移植模型[78]。

GFP转基因小鼠骨髓单个核细胞的提取与分离:颈椎脱臼法处死GFP转基因供体小鼠,浸泡75%乙醇中消毒,超净台中无菌分离双侧股骨和胫骨,剪掉股骨和胫骨两端。将处理过的股骨和胫骨浸泡在PBS缓冲溶液中,用PBS缓冲溶液反复冲洗骨髓腔,直到冲洗液澄清为止,通过70 μm细胞过滤器将骨髓细胞悬浮液转移至50 mL无菌离心管中。以小鼠外周血淋巴细胞分离液经密度梯度离心法获得单个核细胞。移入另一无菌离心管中,加入3~5 倍的PBS缓冲溶液洗涤2次,以1 400 r·min-1离心5 min,制备骨髓单个核细胞悬液,计数。加入PBS缓冲溶液调整细胞浓度约为2×107个/mL,暂时放于冰盒备用。

野生型受体小鼠骨髓移植模型的建立:采用放射源CS137对野生型ICR小鼠全身照射,照射剂量为90 Gy,剂量率采用1 Gy·min-1。照射后2 h内,用乙醚对小鼠行浅表麻醉,通过目内眦迅速注入200 μL供体鼠骨髓单个核细胞悬液。经过移植后小鼠在SPF级实验室饲养4周,进行骨髓重建,期间饲料及垫料均经高压高温消毒处理。

骨髓重建后外周血GFP阳性细胞数量检测:骨髓重建4 周后,取小鼠外周血制备流式细胞样本,通过流式细胞术检测GFP阳性细胞数量,并计算其比例。取ICR野生型小鼠(WT mice)作为阴性对照组,GFP基因鼠(GFP mice)作为阳性对照组。检测小鼠外周血中GFP阳性细胞数量,据此判断骨髓移植造模是否成功。

22单侧后肢缺血损伤模型的建立根据文献方法建立小鼠单侧后肢缺血损伤模型[9]。以15 g·L-1 avertin(165 mL·kg-1)经腹腔注射对小鼠行全身麻醉后备皮,取仰卧位固定。自右后肢腹股沟处横向切口,钝性分离肌肉,暴露起源于髂外动脉,终止于隐静脉和腘动脉的股动脉,以7/0号丝线结扎血管,离断并剪掉股动静脉及其分支,缝合皮肤。采用激光多普勒扫描成像系统检测小鼠结扎并离断股动脉前后结扎部位的血流速度,术后血流速度降低到术前的10%以下,且血流的频谱发生明显的改变,以此作为后肢缺血模型成功建立的标准,然后将小鼠置于37 ℃电热毯上直至苏醒。

23实验分组与给药将脑心通超微粉末加入生理盐水中配成70 g· L-1溶液,分装备用。辛伐他汀加入生理盐水中配成1 g·L-1溶液,分装备用。UHLI成功的54只小鼠,随机分成3 组,每组18 只。本研究中依据体表面积计算法以及脑心通胶囊临床应用剂量换算成小鼠给药剂量。脑心通胶囊临床剂量为成人(口服):一日3 次,一次2~4 粒,04 g/粒,以此确定本研究中小鼠脑心通组等效剂量为700 mg·kg-1·d-1。阳性药组(辛伐他汀)剂量10 mg·kg-1·d-1,模型组给予同体积生理盐水。造模1 h后经灌胃给药,连续给药3,7 d分别进行取材。

24流式细胞术检测外周血EPCs动员参考文献方法[10],分别于小鼠HLI术前、术后1,3,7,14 d,采集经肝素钠抗凝的外周血,分别加入5 μL的PEFlk1和25 μL的APCCy7Sca1,2种小鼠EPC表面标记抗体或同型对照,4 ℃避光孵育30 min,加1 mL红细胞裂解液,孵育2 min,加入适量缓冲液洗去未结合的抗体和红细胞碎片,用FACS 流式细胞仪检测单个核细胞悬液,每份标本检测10万个细胞,以GFP,Flk1,Sca1三阳性细胞占单核细胞的比例表示外周血EPCs数量,用Cell Quest软件分析并记录外周血单个核细胞中GFP+/Flk1+/Sca1+三阳性EPCs的比例。

25免疫荧光法检测EPCs归巢给药3,7 d后,分别取小鼠缺血侧腓肠肌,4%多聚甲醛溶液固定,脱水,石蜡包埋,4 μm厚度连续横向切片。石蜡组织切片,脱水脱蜡后行DAPI染色,DAPI非特异性与细胞核结合呈现蓝色荧光。Nikon倒置荧光显微镜下拍照观察GFP阳性细胞的分布和数量,以绿色荧光蛋白数量来评价EPCs归巢数量。荧光计数:每张切片随机取5个不同视野,非肌肉横切面视野排除在外,以PS软件(Photo Shop 5)计数每个视野内GFP数量或毛细血管数量,EPCs归巢以EPCs数/HPF (× 200)表示。

26统计学处理采用SPSS 160统计软件分析,计量资料采用±s表示,多组间比较采用单因素方差分析,2组间比较采用LSDt法检验,以P<005为差异有统计学意义。

3结果

31骨髓移植小鼠后下肢缺血损伤模型的实验设计第0 周对小鼠进行骨髓移植术,术后将受体鼠饲养于SPF级环境下,进行4 周的骨髓造血重建。骨髓重建4 周后,采用流式细胞术进行GFP骨髓嵌合率的检测。对骨髓移植成功的小鼠继续构建单侧后下肢缺血损伤模型,术后第1,3,7,14 天采用流式细胞术检测外周血中EPCs的数量,术前、术后3,7 d对小鼠进行麻醉后取材,获取损伤侧腓肠肌,放于4%多聚甲醛中固定,进行石蜡包埋切片,以便用于后期EPCs归巢的检测(图1)。

32小鼠骨髓移植后造血重建4周后外周血GFP阳性细胞比例使用小动物活体成像系统检测GFP小鼠的GFP表达,发射波长为520 nm,激发波长为480 nm,曝光时间为1 s,IPP软件定量分析荧光面积。GFP转基因小鼠能全身性稳定表达绿色荧光蛋白,裸露于毛发之外的皮肤在小动物活体成像系统下可见绿色荧光,骨髓移植小鼠与GFP小鼠GFP的荧光表达无显著差异,初步证明骨髓移植模型建立成功(图2 A)。

用Cell Quest软件建立获取模板FSC/SSC双参数散点图,设P1门选定外周血中除细胞碎片外的所有细胞为目的细胞,包括中性粒細胞、单核细胞和淋巴细胞,其中单核细胞和淋巴细胞统称为单个核细胞,黑色信号为细胞碎片。再用该软件建立分析模板SSC/GFP荧光双参数直方图点图,横坐标代表GFP荧光强度,分析外周血中GFP阳性细胞比例。P2门内为外周血中GFP阳性细胞,是绿色信号(中性粒细胞)和蓝色信号(单个核细胞)总和,红色信号为GFP阴性细胞。骨髓移植后第28天,结果显示 BMT小鼠(BMT mice)GFP 阳性细胞达到(9029±60)%,GFP基因鼠的GFP阳性细胞的比例达到(9111±672)%,而野生型小鼠未检测到GFP阳

A BMT 和GFP小鼠活体成像照片;B BMT 和GFP小鼠外周血GFP阳性细胞比例流式细胞分析图,获取图中P1门内为外周血中所有细胞,黑色信号为细胞碎片,分析图中P2门内为外周血中GFP阳性细胞,是绿色信号(中性粒细胞)和蓝色信号(单个核细胞)的总和,红色信号为GFP阴性细胞;C 对B的荧光强度定量分析。

性细胞。可得出在骨髓重建第28天小鼠外周血GFP嵌合率与正常GFP基因鼠相比无统计学差异。据此可以确认本研究成功建立了GFP骨髓移植的动物模型(图2 B,C)。

33脑心通对BMT小鼠HLI后外周血EPCs动员作用本研究运用的是成功建立的 GFP骨髓移植模型小鼠,EPCs为同时表达GFP,Flk1,Sca1的三阳性细胞。术后1,3 d,3 个实验组外周血中EPCs数量均上调,随时间延长术后7 d EPCs含量逐渐降低,术后14 d几乎均降低到术前EPCs的水平。术后1 d,与模型组(073±021)相比,脑心通组(123±021)和辛伐他汀组(103±014)GFP+/ Sca1+/ Flk1+三阳性细胞含量显著性上调(P< 001)。术后3 d,脑心通组(129±021)和辛伐他汀组(087±017)EPCs含量比模型组(069±012)同样显著性上调(P<001,P<005),可知脑心通对EPCs动员的上调作用在术后1 d更显著,脑心通组上调作用比辛伐他汀组更显著(图3)。

34脑心通对EPCs在BMT小鼠缺血腓肠肌的归巢数目的影响倒置显微镜下可见均匀分布的中间散布着GFP绿色荧光,尤其脑心通组和辛伐他汀组荧光表达更强、数量更多;结合取材时,对缺血侧腓肠肌形态和色泽观察比较,可知脑心通组和辛伐他汀组损伤修复较好。术后3 d脑心通组(14550±550)和辛伐他汀组(15133±1451)GFP阳性细胞数目比模型组(3917±564)明显增多(P<0001),并且GFP阳性细胞分布更均匀(图4)。术后7 d脑心通组(11325±743)和辛伐他汀组(11450±1184)GFP阳性细胞数目比模型组(3900±542)明显增多(P<0001),并且GFP阳性细胞分布更均匀(图5)。

4討论

EPCs是一类循环存在于骨髓和外周血中可分化为血管内皮细胞的前体细胞。Asahara等[11]在1997年首次用免疫磁珠法从外周血单个核细胞中分离出来一种CD34+和血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR2+ ) 双阳性的单核细胞,经体外培养进一步证实其能特异性表达内皮细胞抗原,故命名为EPCs。近代研究发现,EPCs不仅参与胚胎早期血管形成,还是与成年个体中血管新生密切相连的一类成熟干细胞,主要定位于骨髓中,在内源性组织缺血、生长因子和药物的刺激下,能够被动员出骨髓,进入外周血循环,进而迁移、归巢到损伤组织处,并增殖、分化为血管内皮细胞,参与损伤组织修复,起到促进血管新生、修复受损血管、维持损伤血管修复动态平衡等作用[1214]。目前研究表明,骨髓、脐血和外周血三者含量之比约为15∶10∶1,在骨髓和外周血中EPCs的比例也只有001%,机体内EPCs数目有限[15],机体这种自我修复作用十分有限。因此,寻找副作用小的、能增加骨髓中EPCs数量并且促进其向血液循环中动员的药物具有重要意义。

缺血性疾病属中医血瘀证范畴,《素问·瘘论》云:心主一身之血脉。心气虚则无力推动血液运行,致瘀血阻滞心脑之络,引起中风、胸痹等诸多病理变化;下肢动脉疾病具有“瘀血、缺血、瘀斑、肿胀、粥样斑块、血栓形成、血管狭窄或闭塞”等“血瘀证”特点,能引起肢体血液循环障碍和微循环障碍,甚至发生溃疡或坏疽[16]。在中医学“异病同治、同证同治”的治疗原则指导下,心脑血管缺血性疾病、下肢缺血性疾病虽然病位不同,但均具有“血瘀证”共同特点。脑心通胶囊是在“补阳还五汤”的基础上加上虫类药将植物类药物和虫类药巧妙合用,具有益气活血,化瘀通脉等功效,具有改善心脑血管功能,增加血流量,改善微循环,改善血液流变学,降低血黏度,抑制血小板聚集,改变血液的高凝状态,增加纤溶活性,抑制血栓形成等作用,缓解心脑缺血症状,改善心脑功能[1718]。脑心通胶囊可有效改善和恢复血管内皮细胞损伤的功能,从而改善内皮舒张功能,改善血管收缩功能,显著减轻缺血引起的心肌细胞变性和坏死[19]。活血化瘀,恢复缺血区域供血,维持血管形态,促进血管新生是治疗缺血性疾病的关键因素。组织缺血缺氧所产生的信号分子可动员骨髓EPCs至外周循环,并归巢于损伤内皮参与新生血管的形成[20]。脑心通胶囊对EPCs动员和归巢的作用尚未见报道。

作为他汀类药物辛伐他汀广泛应用于高脂血症的治疗,同时大量研究表明辛伐他汀可以通过调节血脂、抑制血管内皮炎症反应、稳定粥样斑块、改善血管内皮功能、能通过激活Akt/eNOS 途径改善急性期心功能等作用,降低患者发生心血管事件的风险,显著改善预后,在心血管疾病的防治中具有重要临床价值[2124]。脑心通胶囊是在经方补阳还五汤的基础上结合大量临床实践创制的复方中药,广泛应用于心脑血管疾病的一、二级预防,是治疗缺血性疾病药物的大品种,与辛伐他汀有相似的临床应用。研究证实,辛伐他汀能促进EPCs的动员、增殖、迁移及分化,增加外周循环中EPCs数量,有利于EPCs归巢到缺血损伤部位参与新血管形成[2526]。因此本实验选用辛伐他汀作为观察EPCs动员的阳性对照药。

小鼠后下肢缺血模型是研究缺血性疾病血管再生和EPCs功能的经典模型。与结扎冠状动脉所引起的组织缺血模型相比较,结扎股动脉所引起的缺血模型不仅具有操作简单、死亡率低的优点,而且具备既有明显缺血性组织损伤,又有血管和实质细胞再生修复条件的特征。因此本研究采用骨髓移植联合后下肢缺血损伤小鼠模型,观察脑心通胶囊对EPCs动员和归巢的影响。实验数据表明脑心通胶囊可以增加HLI术后1,3 d外周血中EPCs数量,证实脑心通胶囊可以促进EPCs动员。近年来也有研究发现单味药如黄芪、葛根素、丹参素等对于EPCs具有动员作用,都可通过增加EPCs数量并伴随其功能的改善,促进局部血管新生,改善缺血组织供血[27]。黄芪作为脑心通胶囊的君药其有效成分有可能是发挥该作用的物质基础。本研究采用GFP蛋白示踪方法发现脑心通胶囊可以增加HLI术后3,7 d EPCs在BMT小鼠缺血腓肠肌的数目,进一步证实了其促进EPCs归巢的作用。EPCs归巢于缺血组织主要通过以下3个方面参与新生血管的形成:可直接参与血管形成,修复损伤血管[28];可分化为成熟内皮细胞,参与血管新生;可分泌血管内皮细胞生长因子、基质细胞衍生因子1等多种细胞因子,募集成熟内皮细胞并促进其增殖,共同参与血管修复及新生血管形成[29]。提示脑心通胶囊可通过增强EPCs功能促进缺血组织损伤修复。

综上所述,本研究采用骨髓移植后HLI模型,证实NXT可以通过促进EPCs的动员与归巢,发挥促缺血组织损伤修复作用,为其作为活血化瘀复方中药用于临床治疗缺血性疾病提供了实验依据。

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[责任编辑马超一]

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