张梅梅索化夷 赵 欣 骞 宇李 键 丁阳平 张 玉

(1. 西南大学食品科学学院，重庆 400715；2. 西南大学重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆 400715；3. 重庆第二师范学院重庆市功能性食品协同创新中心，重庆 400067；4. 西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041)

传统发酵牦牛酸乳中细菌素产生菌的筛选与鉴定

张梅梅1,2,3索化夷1,2赵 欣3骞 宇3李 键4丁阳平1张 玉1

(1. 西南大学食品科学学院，重庆 400715；2. 西南大学重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆 400715；3. 重庆第二师范学院重庆市功能性食品协同创新中心，重庆 400067；4. 西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041)

从西藏羊八井地区、云南香格里拉的传统牦牛酸乳中分离出26株乳酸菌，以枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及酿酒酵母为指示菌。采用牛津杯双层琼脂扩散法检测菌株的抑菌谱大小，并经过有机酸排除、过氧化氢排除、蛋白酶水解检测试验，最终筛选得到5株产细菌素的菌株，编号分别为3、23、24、21和25。通过微生物形态学与16S rDNA 序列同源性分析，鉴定这些菌株分别为干酪乳杆菌、植物乳杆菌和乳酸乳球菌乳球亚种。抑菌谱试验表明，这些细菌素能够抑制部分食源性革兰氏阳性菌和阴性致病菌，对真菌无抑菌活性。

牦牛酸乳；乳酸菌；细菌素；筛选；鉴定

牦牛是极端高原环境下的代表性家畜，在中国主要分布于青藏高原地区，是牧民主要的生产生活资料[1]。中国共有牦牛1 400多万头，占全世界牦牛总数的95%以上[2]。牦牛酸乳是由牦牛乳经传统发酵方法制得，发酵过程受极端环境因素的影响，有着复杂的微生物菌群，研究[3]表明这些牦牛酸乳中蕴含着丰富的乳酸菌资源。

细菌素是指乳酸菌在代谢过程中由核糖体合成的一类具有抑菌活性的多肽或蛋白质复合物[4]。它可以选择性地杀死肠道内有害微生物、提高肠道免疫力，控制大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等食源性致病菌，抑制或消灭乳制品、肉制品、果汁饮料等食品中的腐败菌，代替抗生素作为饲料添加剂[5-7]。具替代天然防腐剂和抗生素的潜在应用价值，因此是乳酸菌功能性研究领域的一大热点。

传统发酵的牦牛酸乳中蕴含着丰富的乳酸菌资源，从中筛选出抑菌活性强的细菌素产生菌，对于细菌素的制备和投入生产具有重要意义。目前只有少数学者研究的细菌素产生菌株来源于青藏高原的牦牛酸乳。陈芝兰等[8]从西藏地区发酵牦牛乳中分离出7株产细菌素的乳酸菌，研究表明这些菌株发酵上清液对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有明显抑制作用，对真菌无抑制活性。杨吉霞等[9]从青藏高原的牦牛奶酪中筛选出Y13菌株，其细菌素粗提液对蜡样芽孢杆菌、大肠埃希菌、单增李斯特菌、费氏柠檬酸杆菌和鼠伤寒沙门氏菌有较强的抑制作用。丁武蓉[10]从青藏高原的牦牛酸乳中筛选出德氏乳杆菌保加利亚亚种F17，其对金黄色葡萄球菌和李斯特菌有抑制作用。张艳[11]、崔琴[12]和张丽[13]也分别从四川和甘肃地区牦牛酸奶中筛选和鉴定产细菌素的乳酸菌菌株，其对常见的病原菌均有很好的抑制作用。本研究拟采用分离自西藏羊八井地区和云南香格里拉的26株乳酸菌作为供试菌株，筛选、鉴定出产细菌素的菌株，并对其抑菌特性和抑菌谱进行初步研究，以期为天然生物防腐剂工业化的开发和医药利用提供研究基础，为中国极端环境下乳酸菌菌种资源的开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

供试菌株：26株乳酸菌菌株，1～10号分离自西藏羊八井地区牦牛酸乳，11～26号分离自云南香格里拉牦牛酸乳；

指示菌：致病性菌株(枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌)、非致病性菌株(酿酒酵母)，均为西南大学食品科学学院保藏。

1.1.2 试剂

琼脂、MRS 肉汤、LB 肉汤、马铃薯葡萄糖肉汤、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶：生化试剂，北京索莱宝科技有限公司；

细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)、2×Taq PCR MasterMix：天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 仪器与设备

电子显微镜：OLYMPUS-BX43型，奥林巴斯有限公司；

牛津杯：内径6 mm、外径8 mm、高10 mm，东台市吉泰不锈钢制品厂；

游标卡尺：0～150 mm，无锡锡工量具有限公司；

梯度PCR仪：S1000 Thermal Cycler型，美国Bio-Rad公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菌株的活化镜检 无菌条件下将26个冻干保藏管开封并加生理盐水使冻干菌体溶解呈悬浮状，吸出并移入盛有5 mL MRS液体培养基中，于培养箱中37 ℃培养24 h，即为F1代培养液。将F1代培养液以1% 的接种量转接于MRS液体培养基中，37 ℃培养箱中培养24 h，得到F2代菌株。分别在MRS固体培养基平板上划线，验证菌株纯种。与此同时，对所有菌株作革兰氏染色，电子显微镜观察染色菌体细胞，再次验证菌株纯种[14]。

1.3.2 乳酸菌发酵上清液的制备 参考文献[15]12。

1.3.3 细菌素产生菌的初筛

(1) 指示菌菌悬液的制备[15]12：各指示菌经24 h培养后，用微量加液器取5 mL含盐量为0.85%的生理盐水冲洗长满菌落的试管斜面，菌液转装到5 mL的无菌试管中，振荡均匀后制得菌悬液。通过梯度浓度稀释，得到含菌量约为108CFU/mL的指示菌菌液。

(2) 菌株抑菌谱大小及抑菌活性的检测[16-17]：采用牛津杯双层琼脂扩散法。制成双层培养基平板后，将灭过菌的牛津杯用无菌镊子均匀地放入双层培养基平板中。放置5 min后，利用移液枪向每个牛津杯中加200 μL乳酸菌发酵上清液，分别于适宜的温度下培养24 h后，牛津杯中上清液己完全被吸收。采用游标卡尺测量抑菌圈的直径，挑选出抑菌效果好、抑菌谱较广的菌株。

1.3.4 细菌素产生菌的复筛 参考文献[18～19]做排除有机酸、过氧化氢试验和对蛋白酶的敏感性试验。

1.3.5 细菌素产生菌的鉴定与系统发育树构建 取经过初筛与复筛的菌株培养液按照细菌基因组DNA提取试剂盒的操作说明对菌株进行 DNA 提取，并储存于-20 ℃备用。PCR反应采用25 μL体系：模板 1 μL、27F(10 μmol/L) 1 μL、1495R(10 μmol/L) 1 μL、2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，加入ddH2O补足至25 μL。设置阴性对照，加入以上除了模板的所有试剂，准备完毕后进行PCR扩增。PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1.5 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，共30个循环；72 ℃延伸10 min。反应结束后，取5 μL PCR产物用1.5% 琼脂糖凝胶电泳进行检测。由北京华大基因公司对5株菌16S rDNA进行测序。将所得序列通过NCBI中的GenBank，使用BLAST程序进行比对分析。从GeneBank数据库中调取参考菌株序列，使用Clustalx 1.83软件进行序列匹配比对，通过MEGA 5.0软件中Neighbor-Joining构建分离菌株的系统发育树，置信度检测采用自举法，自举数据集为1 000[20-22]。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌活化菌株形态结构

由图1可知，21、23和25号菌株经培养后，菌落呈乳白色，表面光滑且凸起，边缘整齐。菌株经革兰氏染色后，在显微镜下呈蓝紫色，形态分别为杆状和球形，符合乳酸菌特征。

2.2 细菌素产生菌的初筛结果

采用牛津杯双层琼脂扩散法检测抑菌谱大小，部分初筛效果见图2，产生的抑菌谱见表1。与前人[15]43[18-23]的初筛结果进行对比，从26株乳酸菌中筛选出7株对致病性指示菌均有较强抑制作用的菌株。它们的编号分别为3、10、11、21、23、24、25，抑菌结果见图3。

由图3可知，所筛选出的7株乳酸菌菌株既抑制革兰氏阳性菌，又抑制革兰氏阴性菌，且抑菌活性较高，其上清液对枯草芽孢杆菌的抑菌效果好于金黄色葡萄球菌。由表1可知，21号菌对枯草芽孢杆菌抑制效果最好，其抑制圈直径为18.48 mm；11号菌对大肠杆菌抑制效果最好，其抑制圈直径为14.64 mm；21号菌对金黄色葡萄球菌抑制效果最好，其抑制圈直径为11.70 mm，所有菌株对酿酒酵母无抑菌活性。

† -表示抑菌圈直径≤8 mm；+表示抑菌圈直径8～10 mm；++表示抑菌圈直径10～12 mm；+++表示抑菌圈直径≥12 mm。

2.3 细菌素产生菌的复筛结果

2.3.1 有机酸排除结果 抑制指示菌的物质可能是细菌素也可能是酸，因此需要排除有机酸的干扰。将去除菌体的发酵上清液的pH 值调至4.5[15]17，以致病性菌株为指示菌进行抑菌试验，抑菌结果见表2。

由表2可知，当把MRS液体培养基的pH调到4.5时，对指示菌无抑制作用，而发酵上清液在此pH条件下有抑制作用，说明发酵上清液中确有抑菌活性物质存在[24]。编号为3、21、23、24、25菌株的发酵上清液pH调为4.5后，其对各指示菌抑菌活性的下降都低于15%。姚丽娅等[25]从传统发酵制品中分离出的S1-1菌株经有机酸排除试验后，其抑菌活性下降了26.47%。淮骏[15]17从黄瓜汁里分离出的H1菌株，经有机酸排除试验后，其对枯草芽孢杆菌的抑菌活性分别下降了30%。因此这些菌株经有机酸排除试验后，不仅具有抑菌作用，而且抑菌作用相对理想。故各菌株的抑菌性不是有机酸作用的结果，还有其他抑菌物质存在。

2.3.2 过氧化氢排除结果 过氧化氢是乳酸菌的一种代谢合成产物，能够抑制微生物的生长，因此必须排除过氧化氢的干扰。故将上述7株菌的发酵上清液经80 ℃加热处理10 min，使过氧化氢充分分解，冷却后以致病性菌株为指示菌进行试验，抑菌结果见表3。

由表3可知，7株菌株经过氧化氢排除试验后，抑菌圈直径均无明显变化。其中11号菌株加热前后对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径变化最大，其抑菌性下降了8.60%。曹珂珂等[26]从植物性原料中分离出的B-17菌株，其发酵上清液经 80 ℃水浴 10 min后，抑菌性下降了10.3%。张彦斌等[27]从内蒙古传统乳制品中分离的S4-3-1菌株用过氧化氢酶处理发酵上清液，其抑菌活性下降了15.51%。由此可见，这7株菌仍有较强的抑菌性，说明发酵上清液中主要的抑菌物质不是过氧化氢。

2.3.3 菌株的酶水解试验结果 在排除有机酸和过氧化氢的抑菌作用后，以这7株菌作为目的菌株，以枯草芽孢杆菌为指示菌。对其发酵上清液进行胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶水解试验，以检测发酵液中具有较强抑菌性的物质是否为蛋白质，结果见表4。

由表4可知，酶处理后3、21、23、24和25菌株上清液产生的抑菌圈明显小于原上清液产生的抑菌圈，其中21号菌株对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径明显减小，抑菌活性下降了58.23%。但10、11号菌株的抑菌活性下降得较少，分别为2.00%和3.08%，可见其抑菌物质对蛋白酶不敏感。由于细菌素具有蛋白质特性，因而在各种消化酶处理后，其抑菌活力会有不同程度的下降[28]。因此可以初步推测3、21、23、24和25这5株乳酸菌产生的抑菌物质具有蛋白质性质，即细菌素；10、11号菌株其抑菌物质含蛋白质类似物极少，因此其活性物质为非蛋白组分或者起抑菌作用的不是单一的物质。

2.4 细菌素产生菌的16S rDNA序列同源性鉴定结果

通过对牦牛酸乳中分离出的乳酸菌进行细菌素产生菌的初筛和复筛，综合比较得出编号为3、21、23、24、25菌株有较好的抑菌活性。这5株菌株总DNA经PCR 扩增、电泳后的结果见图4，可知扩增后的电泳条带集中在1 500 bp左右，符合乳酸菌扩增片段长度；阴性对照无条带，说明未出现污染。16S rDNA 比对结果见表5。

2.5 系统发育树分析

将5株分离菌株测序结果与GenBank中已有序列进行比对分析，结果表明分离菌株同源性均在100%，大于分类研究阈值97%[29]，系统发育树中，各分支长度间的差异代表物种进化程度的高低。由图5可知，鉴定已知的5株乳酸菌分为2个进化枝，表明5株乳酸菌分为2个遗传类型。干酪乳杆菌(编号为3、23、24)和植物乳杆菌(编号为21)处在同一分枝中，乳酸乳球菌乳球亚种(编号为25)处于另一分支，表明干酪乳杆菌与植物乳杆菌的亲缘关系很近，同属于乳杆菌属。因此试验菌株涉及乳球菌属和乳杆菌属。其中编号为3、23、24、21和25 的菌株都以100% 的自举支持率分别与干酪乳杆菌、植物乳杆菌和乳酸乳球菌乳球亚种聚在一起。可见，系统发育树分析结果与16S rDNA 序列分析结果相一致。

3 结论

本试验通过对传统发酵牦牛酸乳中细菌素产生菌的筛选，得到5株对致病性指示菌(枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)有较好抑制作用的乳酸菌，经微生物形态学与分子生物学鉴定结果表明，编号 3、23和24菌株为干酪乳杆菌、编号21菌株为植物乳杆菌、编号25菌株为乳酸乳球菌乳球亚种。干酪乳杆菌、植物乳杆菌和乳酸乳球菌乳球亚种均为食品上可用菌，而在已有的细菌素产生菌的筛选研究中，所得菌株很多并非食品中可用。因此本研究的结果可用于食品中以防范食源致病菌对食品的污染。

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Screening and identification of lactobacillin-producing strain in traditional yak yogurt

ZHANG Mei-mei1,2,3SUOHua-yi1,2ZHAOXin3QIANYu3LIJian4DINGYang-ping1ZHANGYu1

(1.CollegeofFoodScience,SouthwestUniversity,Chongqing400715,China; 2.ChongqingEngineeringResearchCenterofRegionalFood,Chongqing400715,China; 3.ChongqingCollaborativeInnovationCenterforFunctionalFood,ChongqingUniversityofEducation,Chongqing400067,China; 4.CollegeofLifeScienceandTechnology,SouthwestUniversityforNationalities,Chengdu,Sichuan610041,China)

The 26 strains isolated from traditional fermented yak milk in Yangbajin-Tibet and Yunnan-Shangrila area. In this study, the inhibitory spectrum of the selected strain was determined by Oxford cup double agar diffusion methodBacillussubtilis,Escherichiacoli,Staphylococcusaureusand Yeast was taken as the indicator, to screen out lactic acid bacteria with high antibacterial activity from various stains. At the same time, according to the exclusion of organic acids, hydrogen peroxide and proteolysis detection, speculated that the inhibitory effect of lactic acid bacteria may come from lactobacillin. The results showed that 3, 21, 23, 24, 25 strains have higher antibacterial activity. And 5 strains were identified by 16S rDNA sequence analysis. The 3, 23 and 24 asLactobacilluscasei, 21 asLactobacillusplantarum, 25 asLactococcuslactissubsp. lactis. Antibacterial spectrum test showed that lactobacillin could effectively inhibit some food-borne gram positive and negative bacteria. All isolated strains had no antimicrobial activity against fungi.

yak yogurt; Lactic acid bacteria; bacteriocin; strain screen; identification

国家公益性行业(农业)科研专项(编号：201303085)；重庆市社会民生科技创新专项(编号：cstc2015shmszx80021)；重庆市特色食品工程技术研究中心能力提升项目(编号：cstc2014ptgc8001)；重庆市功能性食品协同创新中心建设项目(编号：167001);中央高校基本业务费专项资金(编号：XDJK2017D122)

张梅梅，女，西南大学在读硕士研究生。

索化夷 (1978—)，男，西南大学副教授，博士。 E-mail:birget@swu.edu.cn

2017—01—01

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.03.005