王云雀，黄湘壹

（1.武汉理工大学 校医院，湖北 武汉 430070；2.南华大学附属第二医院，湖南 衡阳 421001）

MicroRNA-223表达与肝癌根治性切除术预后的相关性

王云雀1，黄湘壹2

（1.武汉理工大学 校医院，湖北 武汉 430070；2.南华大学附属第二医院，湖南 衡阳 421001）

目的识别可以作为肝癌根治性切除术患者预后标志物的microRNA（miRNA）分子。方法 利用miRNA微阵列方法对2例原发性肝癌及对应的肺转移性肝癌进行miRNA表达分析。将原发性和转移性肝癌中表达量有2倍差异的miRNAs作为候选miRNAs分子。在miRNA验证过程中，运用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）分析37例肝癌及相应癌旁非肿瘤组织中候选miRNAs分子的表达，并将其与患者的临床病理特征及生存情况进行相关性分析。结果 最终选取8种miRNAs（miR-27b、122、142-5p、196a、223、590-5p、630及944）作为候选miRNA。只有miR-223表达水平与肿瘤分期、有丝分裂指数相关。将肝癌患者分为miR-223高表达组（25例）和miR-223低表达组（12例）后发现，miR-223高表达与较高T分期、淋巴结转移、较高丝分裂指数及较高Ki-67阳性指数相关。此外，miR-223高表达还与总体生存率和无病存活率下降相关（P＜0.05），中位随访时间37.9个月[疾病复发危险比为16.267（95%CI：1.732，153.789）P=0.015]。结论 肝癌组织中miR-223异常表达与肝癌患者治疗结束后发生复发转移，以及无病生存时间和总生存率有关，通过检测肿瘤组织中miR-223 qRT-PCR反应有可能预测患者预后。

肝癌；microRNA；microRNA-223

肝癌是全球常见的一种高发病率和高致死率的消化道恶性肿瘤[1]。据2012年全球肿瘤流行病统计数据显示，全世界每年新发癌症患者约1 410万例，每年死于癌症的患者约820万人，其中肝癌新发患者＞100万，每年约有80万例患者死于肝癌，占癌症死亡率的9.1%，5年生存率＜50%，已上升至癌症致死原因的第2位，仅次于肺癌（160万，19.4%）[2]。寻找和发现有效的预测指标，对高危复发的患者进行有效的个体化治疗，降低复发率，是提高肝癌治疗效果的关键，也是肝癌研究的热点。因此，研发新的肝癌生物标志物有助于肝癌预后预测和进一步促进肝癌精准治疗的发展。

MicroRNA（miRNA）是一系列高度保守非编码RNA，通过调节多种基因的表达发挥效应。近年来有研究发现，癌症组织中的miRNA表达异于正常组织，很多miRNA具有致肿瘤活性或肿瘤抑制活性[3-4]。例如，FRANCESCA等[3]研究表明，肝癌miR-519d表达变化可能与不良临床结果相关，能够作为肝癌独立预后生物标志物。LING等[4]认为，上调miR-210能增强肝癌细胞系HepG2的增殖和黏附。本研究表明，miRNA在肝癌发生、发展中发挥重要作用，可以作为肝癌诊断的生物标志物。本研究旨在寻找和发现可以作为肝癌根治性切除术患者预后标志物的新miRNAs分子。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2010年1月-2012年12月南华大学附属第二医院普外科接受根治性切除术的肝癌患者37例，患者中位年龄（57.2±13.3）岁。其中，男性25例，女性12例。28例患者发生淋巴结转移。

1.2 研究步骤

本研究分2步进行：①差异miRNA筛选；②差异miRNA验证。为筛选差异miRNA，本研究选择2例肺转移的肝癌患者，2例患者接受肝癌和肺转移癌的切除手术，收集肝癌和肺转移癌手术切除标本，miRNA表达微阵列检测两组组织标本中miRNA的表达差异。用原发性和转移性肿瘤中表达差异＞2倍的miRNA作为候选预后差异miRNA。随后采用实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）验证37例接受根治性治疗的肝癌患者肝癌组织中候选miRNA的表达。所有患者接受定期随访，直至死亡或随访结束（2015年12月）。平均随访时间34.3个月（11～52个月）。患者定期接受身体检查，如有必要进行CT扫描。总生存期指手术至死亡间隔。

1.3 肝癌组织总RNA提取

采用miRNA提取试剂盒mirVana RNA Isolation Kit分别提取肝癌组织和肺转移癌组织标本总RNA，具体操作方法按说明书进行。用生化分析仪2100 Bioanalyzer定量，琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA的完整性。

1.4 miRNA表达微阵列检测

对从原发性肝癌组织（Cy5标记）和肝癌肺转移组织（Cy3标记）中获得RNA样本的2个实验重复进行杂交实验。使用激光扫描仪获得杂交图像，并使用Array-Pro图像分析软件进行数字化。首先消除背景感染，然后使用LOWESS过滤器对信号进行归一化，对数据进行分析。筛选表达差异＞2倍的miRNA。

1.5 qRT-PCR验证差异miRNA在肝癌组织中的表达

总RNA反转录后的第1链cDNA为模板，进行聚合酶链反应扩增。95℃预变性20s，95℃变性10s，60℃退火20 s，70℃延伸10 s，共40个循环，以U6snRNA作为内参，绘制扩增融解图，将样本miRNA与U6snRNA基因含量的差值作为评价miRNAs相对表达水平的指标，据公式ΔCt=[Ct （miRNA）]-[Ct（U6snRNA）]，取ΔCt的均数±标准差（±s）为检测结果。

1.6 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 筛选肝癌预后标志物的候选miRNAs分子

miRNA差异分析显示，原发性肝癌和肝癌肺转移性组织中18种miR表达。miR-122、485-3p、711 及944在肝癌肝转移性组织中的表达量是原发性肝癌中的2倍甚至更多；而miR-27b、14-5p、196a、206、223、320c、38-5p、449c、590-5p、630、1293、1 978、2 116 及2 277在肝肝癌肝转移性组织中的表达量比原发性肝癌减少≥2倍。18种miRNA中，笔者选取miR-27b、122、142-5p、196a、223、590-5p、630及944进一步分析。见图1。

图1 肝癌肺转移瘤和原发瘤中miRNA表达差异

2.2 验证候选miRNAs分子作为肝癌的预后标志物

随访期期间6例患者（16.2%）发生肝癌复发。采用qRT-PCR分析8种miRNAs在37例肝癌及相应癌旁非肿瘤肝样本中的表达水平，并分析其表达与临床病理特点的相关性。miR-223的表达水平在临床分期Ⅲ期、淋巴结转移、TNM分期更高、有丝分裂指数高（每10个高倍镜视野＞2）、Ki-67阳性指数高（3%）及复发患者中增高（P＜0.05）。miR-142-5p的表达水平在有丝分裂指数高患者中也升高（P＜0.05）。miR-27b表达水平在不同有丝分裂指数和是否复发患者中比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见附表和图2、3。

附表 不同影响因素间miR-27b、122、142-5p、196a、223、590-5p、630及944在肝癌组织表达水平的比较 （±s）

附表 不同影响因素间miR-27b、122、142-5p、196a、223、590-5p、630及944在肝癌组织表达水平的比较 （±s）

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2.3 miRNA-223作为肝癌预后标志物价值的分析

本研究利用受试者工作特征分析miR-223、27b 及142-5p作为预测肝癌根治治疗后复发指标的潜能，结果发现，肝癌组织中miR-223表达水平能识别肝癌复发患者[曲线下面积（area under curve，AUC）=0.833（95%CI：0.658，1.000），P=0.011]。其中miR-196a相对表达量的临界值是1.279，敏感性和特异性分别是83.3%和83.9%。本研究还发现，肝癌组织中miR-27b的表达水平也能区分肝癌复发患者[AUC=0.747（95%CI：0.516，0.978），P=0.058]，临界值是0.378。而miR-142-5p不能有效识别肝癌复发患者 [AUC=0.543，（95%CI：0.227，0.859），P=0.742]。将miR-223表达水平临界值设为1.279，依此把患者分为miR-223高表达组（25例）和低表达组（12例）。miR-223高表达组患者组织学分级、有丝分裂指数、Ki67阳性指数、发生血管淋巴管浸润的频率、TNM分期和临床分期均高于低表达组（P＜0.05）。除此之外，miR-223高表达组患者无病生存率（disease-free survaval，DFS）和总生存率（overall survival，OS）低于低表达组（DFS分别为38.9%和95.5%；OS分别为90.0%和100%，P=0.000和0.046）。尽管miR-27b高表达组OS小于低表达组（P=0.016），但是miR-27b高表达组的DFS与低表达组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。miR-142-5p表达水平高患者和表达水平低患者的OS、DFS比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。Cox回归分析显示，miR-223高表达组患者复发率（单变量分析HR=20.299，多变量分析HR=16.267）。单变量分析和多变量分析（HR=7.637和6.697）显示，miR-27b高表达组复发率与低表达组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。正如预期所示，临床分期、TNM分期是DFS和OS的重要的预测因素，高临床分期（P= 0.000）和高TNM分期（P=0.000）患者DFS较低，同样高临床分期（P=0.000）和高TNM分期（P=0.020）患者OS较低。见附表和图4。

续附表

图2 miR-223表达与肝癌患者临床病理特征的关系

图3 miR-223在癌旁非肿瘤组织和肝癌组织中的表达

图4 卡普兰Meier曲线分析miR-223和27b表达对37例肝癌患者OS、DFS表达的影响

3 讨论

手术切除一直以来是肝癌的首选治疗手段，也是肝癌患者获得长期生存的最主要治疗手段。但是，除肿瘤分级和TNM分期以外，肝癌的有效预后指标很少；且寻找新的预后标志物有利于对该临床上和生物学上具有异质性的肿瘤进行分层。本研究发现，组织中miR-223的表达水平可以作为预测肝癌患者复发和生存的标志物。过去一段时间内，表观遗传学研究越来越得到关注；其中miRNAs由于表达十分稳定，且比较容易在血清/血浆，以及新鲜的和石蜡包埋的组织中检测出，得到学者们的青睐，大量研究探讨miRNA作为多种肿瘤标志物和治疗靶点的潜力。研究报道，肝癌中会发生多种miRNAs表达水平的上升或下降，包括miRNA-21、34、146a、155、196a-2、200a/b及1290[5-6]。但是，关于miRNAs对肝癌诊断和预后价值的研究不多见。

迄今为止，关于肝癌的研究已经发现miR-21、642及193b的高表达与肝癌细胞增殖活性和转移性增强有关[7]。本研究发现，miR-223表达水平增高与肿瘤分级升高（也就是Ki-67增殖活性增高和有丝分裂指数增高）、肿瘤分期升高和其它侵袭性表现有关（例如淋巴管血管浸润和淋巴结转移）。此外，miR-223高表达组患者5年DFS和OS降低。上述结果表明，miR-223可以作为根治性治疗术后肝癌的预后标志物。据笔者所能查阅到的文献，本研究是首次通过长期跟踪随访肝癌患者，分析miR-223a对肝癌患者的预后判断价值。

近期有研究报道，miRNA-223的功能，miR-223高水平能促进细胞生长和抗凋亡能力[8]；且miR-223能促进胃癌细胞的迁移和远处转移，根蛋白是其直接的作用靶点[9]。miR-223与同源异型（Homebox，HOX）簇有互补性，并能抑制目标HOX基因，包括HOXB8、HOXD8及HOXA7[10]。此外，miR-223还在胰腺癌细胞的增殖和上皮间质转化过程中发挥重要作用，其可能的作用靶点是核因子κB抑制剂[11]。研究发现，miR-223具有作为多种疾病预后和诊断标志物的潜能，包括家族性和散发型肿瘤和胰腺导管内乳头状瘤[12-13]。比如，血清miR-223水平能够预测胰腺导管腺癌的存活率下降，胰液中miR-223的水平升高对肠型胰腺导管内乳头状瘤有预测作用[14]。

本研究发现，miR-223高表达与肝癌侵袭性行为和预后较差有关；但是本研究中筛选部分实验发现，肝转移性肝癌中miR-196a表达水平比原发性肝癌低，似乎与预期不相符，未来还需要进一步深入研究。本实验没有研究转移性肝癌中miR-223的表达水平。有趣的是，肝转移性肝癌中miR-27b与miR-142-5p-2 miRNAs表达水平比较，差异无统计学意义；但这2种miRNAs表达水平也与侵袭性行为有关（高分期、有丝分裂指数、Ki-67阳性指数和高复发频率）。此外，本实验通过对原发性肝癌及相应的肝转移肝癌进行核糖核酸-荧光原位杂交分析发现，肝转移肝癌的miR-196a表达水平低于原发性肝癌。尽管还需要功能性研究的进一步验证，但是笔者可以推断，虽然miR-223的表达与肝癌的侵袭性行为（包括浸润和转移）相关，但是一旦肿瘤发生转移，其表达会受到抑制，这有可能是因为新的肿瘤微环境作用。

总之，本研究发现，组织中miR-223表达水平有可能作为判断根治性治疗后肝癌复发的预测指标，但是未来还需要大样本量研究进一步证实。

[1]YANG H I,LU S N,LIAW Y F,et al.Hepatitis B e antigen and the risk of hepatocellular carcinoma.[J].New England Journal of Medicine,2002,347(3)：168-174.

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[3]FRANCESCA F,MADDALENA M,PASQUALE C,et al.In hepatocellular carcinoma miR-519d,is up-regulated by p53 and DNA hypomethylation and targets CDKN1A/p21,PTEN,AKT3, and TIMP2[J].Journal of Pathology,2012,227(3)：275-285.

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[10]LI X,ZHANG Y,ZHANG H,et al.miRNA-223 promotes gastric cancer invasion and metastasis by targeting tumor suppres sor EPB41L3[J].Molecular Cancer Research,2011,9(7)：824-833.

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（童颖丹 编辑）

Value of miRNA-223 expression in predicting outcome of hepatocellular carcinoma after radical therapy

Yun-que Wang1,Xiang-yi Huang2
(1.School Hospital,Wuhan University of Technology,Wuhan,Hubei 430070,China;2.The Second Affiliated Hospital,University of South China,Hengyang,Hunan 421001,China)

ObjectiveTo identify miRNAs that could be potential prognostic biomarkers of hepatocellular carcinoma in patients who underwent radical resection.Methods For miRNA target screening,2 primary HCC and the corresponding liver metastases were screened for miRNA expression by the miRNA Chip analysis. Candidate miRNAs were selected by more than 2-fold difference of expression between metastatic and primary tumors.For miRNA target validation,qRT-PCR was performed for candidate miRNAs on 37 HCC and the matched paracancerous non-tumor tissues,and the correlations of the miRNA levels with the clinicopathological features and survival were analyzed.Results Eight miRNAs(miRNA-27b,122,142-5p,196a,223,590-5p, 630,and 944)were selected as candidate miRNAs.Only miR-223 level was significantly associated with tumor stage and mitotic count.When the HCC patients were stratified into high(25 cases)and low(12 cases)miRNA-223 expression groups,high miRNA-223 expression was associated with advanced T stage,lymphatic metastasis,higher mitotic counts,and higher Ki-67-labeling index.In addition,high miRNA-223 expression was associated with decreased overall survival and tumor-free survival(P＜0.05)during a median followup of 37.9 months[the hazard ratio for recurrence=16.267(95%CI:1.732,153.789),P=0.015].Conclusions High miRNA-223 expression has a significant relation with poor outcome of patients with HCC.

hepatocellular carcinoma;microRNA;miR-223

R735.7

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.06.012

1005-8982（2017）06-0059-06

2016-08-02

黄湘壹，E-mail：417354749@qq.com；Tel：13786494910