张明杰，李宗泽，徐杨，梁迅

（锦州医科大学 生物化学与分子生物学教研室，辽宁 锦州 121000）

小鼠CD45-/CD31+肺侧群细胞诱导分化的研究*

张明杰，李宗泽，徐杨，梁迅

（锦州医科大学 生物化学与分子生物学教研室，辽宁 锦州 121000）

目的探讨在体外诱导分化肺侧群细胞（SP）的特性。方法 取小鼠肺组织，流式细胞术分选小鼠白细胞分化抗原（CD）45-/CD31+肺SP；免疫荧光检测分选肺SP三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2（ABCG2）的表达；逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测肺SP中ABCG2、酪氨酸激酶2（Tie2）及血管性血友病因子（vWF）的表达。细胞体外分化诱导14d后，免疫荧光检测细胞vWF的表达；RT-PCR检测分化诱导前后细胞中ABCG2和vWF的表达。结果 流式细胞术成功分选出CD45-/CD31+肺SP细胞，免疫荧光检测其表达ABCG2；RT-PCR检测SP表达ABCG2和Tie2，不表达vWF。主群细胞表达vWF；分化诱导前的肺SP表达ABCG2；分化诱导后的肺SP表达vWF。结论 CD45-/CD31+肺SP是血管内皮细胞的祖细胞，具有干细胞分化特性。在体外培养可分化为血管内皮细胞。

侧群细胞；血管内皮细胞；三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2

肺疾病是引起死亡的主要原因[1-3]。肺移植并不是5年死亡率＜50%的万灵药[4]，因此迫切需要新方法。侧群细胞（side population cells，SP）是利用Hoechst染料和流式细胞仪进行造血干细胞分离时发现的特殊细胞。白细胞分化抗原（cluster of differentiation，CD）45+为血液细胞标记，CD45-为肺细胞标记，CD31+为内皮细胞标记，CD31-为间充质细胞标记。以往的研究对CD45+和CD31-已做报道，但未报道CD45-/CD31+[5-7]。本实验收集小鼠肺，流式细胞术分选出CD45-/CD31+侧群细胞，体外诱导培养，探讨其是内皮细胞的祖细胞，可以在体外发育成内皮细胞，为临床治疗肺疾病提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要试剂 内皮培养基（endothelial cell growth medium-2，EGM-2），购自美国 Cambrex公司，Methocult GF M3534购自加拿大STEMCELL Technologies公司，Tryspin购自美国Sigma公司，胶原酶、分散酶购自上海吉凯基因化学技术有限公司，RNA提取试剂盒购自德国QIAGEN公司，cDNA逆转录试剂盒购自美国ABI公司，逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RTPCR）试剂盒购自美国Promega公司，抗体购自英国Abcam公司，Hoechst33342、DAPI、胰蛋白酶、维拉帕米及碘化丙啶（propidium iodide，PI）仪购自美国Sigma公司。

1.1.2 实验仪器 二氧化碳CO2孵箱购自美国Sheldon Manufacturing Inc公司，流式细胞仪购自美国贝克曼库尔特公司，超净工作台购自新加坡ESCO公司，酶标仪购自德国BMG公司，离心机购自德国Het-tich公司，聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪购自美国Thermo Scientifics公司。

1.1.3 实验动物 实验小鼠来自辽宁省锦州医科大学动物实验中心。

1.2 实验方法

1.2.1 收集细胞 取小鼠肺组织用刀片搅碎，在37℃、0.1%胶原酶、2.4 u/ml分散酶和2.5 mmol CaCl2条件下孵育1 h，磷酸盐缓冲溶液（phosphate belanced solution，PBS）悬浮、过滤，收集细胞[8]。

1.2.2 流式细胞术分选CD45-/CD31+小鼠肺侧群细胞及检测 取收集的细胞计数，将细胞数量调整为1×106个/ml浓度，重悬细胞于培养液中。实验组加入终质量浓度为5 mg/L的荧光染料Hoechst33342；对照组加入终质量浓度为5 mg/L的荧光染料Hoechst 33342及终质量浓度为100 mg/L的维拉帕米。37℃避光水浴90min，每隔20min轻微震荡1次。90min后终止染色，用冷的PBS洗涤，4℃、1 000r/min离心5 min，去上清液，用冷的PBS重悬。加入终质量浓度为 2 mg/L的 PI，上流式细胞仪分选，Hoechst33342的激发光为375 nm。流式细胞仪分别收集侧群细胞与主群细胞。用CD44和干细胞抗原1 （stem cell antigen 1，Sca1）抗体检测其表达情况[9]。

1.2.3 免疫荧光染色检测三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2（ATP-binding cassette sub-family G member 2，ABCG2）蛋白表达 将玻片放在流式细胞仪特定位置收集细胞。丙酮固定几秒（-20℃），PBS漂洗3次，2 min/次。0.5%Txiton X-100处理20 min，PBS漂洗3次，2 min/次。血清封闭20 min，PBS漂洗3次，2 min/次。滴加一抗，37℃孵育2 h，PBS漂洗3次，2min/次。滴加二抗，37℃孵育30min，PBS漂洗3次，2 min/次。加入4'，6-二脒基 -2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色5min，PBS漂洗3次，2min/次。荧光显微镜观察并拍照。

表1PCR引物序列

1.2.4 RT-PCR检测ABCG2、血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）及酪氨酸激酶2（tyrosine kinase，Tie2）基因的表达 收集的细胞用冷的PBS漂洗2次，12 000 r/min离心3 min，弃上清液，加入350 μl裂解缓冲液，充分裂解。加入1ml Trizol，冰上匀浆。转入新的1.5 ml离心管，室温保存5 min。加0.2 ml氯仿，震荡混匀，室温放置5 min。4℃、10 000 r/min离心15 min，将上层吸到一个新的1.5 ml离心管，按照试剂盒说明书提取RNA。按照试剂盒说明书将其逆转录成cDNA。按照试剂盒说明书进行PCR反应，反应条件为：95℃预变性3 min，95℃变性1 min，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30个循环，72℃继续延伸10 min。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。见表1。

1.2.5 细胞克隆形成实验及流式细胞术检测其是否为CD45-/CD31+小鼠肺侧群细胞 用Methocult GF M3534 media培养基连续培养CD45-/CD31+小鼠肺侧群细胞14 d，用流式细胞仪检测。

1.2.6 细胞体外分化诱导及免疫荧光检测vWF表达和RT-PCR检测ABCG2的表达 将流式细胞仪分选的细胞用EGM-2培养基在37℃、5%CO2条件下，连续培养14 d。14 d后，取一部分培养的细胞应用免疫荧光技术检测ABCG2的表达，再取一部分培养的细胞（14 d）和新分选的细胞（0 d）通过RT-PCR反应检测两者ABCG2和vWF的表达，方法同1.2.4。通过Image Pro Plus 6.0软件进行分析，测其积分光密度值，以各条带值与内参条带值之比为目的基因的相对表达量。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 分选的CD45-/CD31+小鼠肺侧群细胞

分离的收集的细胞经过流式分选后，侧群细胞位于左下角两种荧光均很弱的区域。实验组低染区侧群细胞比例为0.4%，对照组低染区侧群细胞比例＜0.4%，被维拉帕米阻滞，证实从小鼠肺组织收集的细胞中确实存在侧群细胞。进一步分选出CD45-/CD31+肺侧群细胞，所占比例为22%。CD分化群44及Sca1检测结果呈现CD44阴性，Sca1阳性。见图1。

2.2 ABCG2蛋白的表达

分选的CD45-/CD31+肺侧群细胞进行免疫荧光染色，观察到细胞表达ABCG2蛋白。见图2。

2.3 ABCG2、vWF及Tie2基因的表达

RT-PCR检测基因表达，结果呈现肝脏特异性脂蛋白（liver specific lipoprotein，LSP） 高表达ABCG2，肺主群细胞（lung main population，LMP）不表达ABCG2。LSP表达的ABCG2相对含量与LMP比较，经t检验，差异有统计学意义（t=58.441，P= 0.000）。LMP高表达vWF，LSP不表达vWF，LSP表达的vWF相对含量与LMP比较，经t检验，差异有统计学意义（t=-12.291，P=0.000）。Tie2在LSP与LMP中均表达，LSP表达的Tie2相对含量与LMP比较，经t检验，差异有统计学意义（t=-95.905，P= 0.000）；Tie2是内皮细胞的标记，提示LSP可能是内皮细胞的祖细胞。见表2和图3。

图1 分选的小鼠CD45-/CD31+肺侧群细胞

2.4 CD45-/CD31+小鼠肺侧群细胞的检测结果

分选的CD45-/CD31+肺侧群细胞克隆形成实验后，结果呈现LSP大量增殖并呈现聚集生长状态，流式技术结果呈现Sca1阳性，其仍然是CD45-/CD31+小鼠肺侧群细胞。见图4、5。

2.5 vWF和ABCG2的表达

细胞体外分化诱导，免疫荧光检测结果呈现有ABCG2的表达；RT-PCR检测结果呈现诱导前的LSP表达ABCG2，诱导后的LSP不表达ABCG2，诱导前LSP表达的ABCG2相对含量与诱导后比较，经t检验，差异有统计学意义（t=62.682，P=0.000）。诱导后的LSP表达vWF，诱导前的LSP不表达vWF，诱导前的LSP表达的vWF相对含量与诱导后比较，经t检验，差异有统计学意义（t=-19.503，P=0.000）；说明CD45-/CD31+小鼠肺侧群细胞分化成血管内皮细胞。见图6、7和表3。

图2ABCG2蛋白的表达 （×40）

表2CD45-/CD31+肺SP与肺MP的ABCG2、vWF及Tie2相对表达量比较 （n=8，±s）

表2CD45-/CD31+肺SP与肺MP的ABCG2、vWF及Tie2相对表达量比较 （n=8，±s）

?

图3ABCG2、vWF及Tie2的表达

图4 CD45-/CD31+小鼠肺侧群细胞克隆形成

图5 流式细胞仪检测CD45-/CD31+

图6vWF的表达 （×40）

图7ABCG2和vWF的表达

表3 诱导前后侧群细胞ABCG2、vWF的相对表达量比较（n=8，±s）

表3 诱导前后侧群细胞ABCG2、vWF的相对表达量比较（n=8，±s）

?

3 讨论

近年来，对侧群细胞的研究和应用都取得很大进展，侧群细胞由于分布广泛，含量丰富，又有明确的表型标记和分离纯化方法，所以可以用于基因治疗、生物医学研究、生长发育过程研究等领域。侧群细胞可以通过不对称分裂产生大量与自己相同的子代细胞，同时也能分化成具有有限分化能力的后代。MOSERLE等[10]发现，肝癌细胞株Hep3B、MHCC97-L、MHCC97-H及HCCLM3所含的侧群细胞比例分别为0.9%、4.2%、14.5%和28.7%，所得高纯度的侧群细胞在体外培养后，这4种细胞株始终能保持一定的侧群细胞比例，说明侧群细胞具有自我更新的功能，这有助于维持稳定的细胞储备。新的研究表明，侧群细胞及肿瘤干细胞驱动和维持人类肿瘤的多种类型[11]。侧群细胞在动物模型中能够产生肿瘤，非侧群细胞则不能[12]，从肿瘤干细胞中分离侧群细胞，进而研究侧群细胞的特性[13]。侧群细胞的克隆形成和侵袭能力明显高于非侧群细胞，该特征进一步表明侧群细胞的其他属性[14]。同时，对肺侧群细胞进行研究，对肺损伤及肺部疾病的治疗有非常重要的意义，对肿瘤的防治和干细胞生物学的发展有深远的影响[15]。

肺是呼吸系统的一部分，功能是进行气体交换，良好的肺功能是维持生命的保障。胸外科角度上肺是胸腔内最大的脏器，也是胸外科中病变种类和发病数量最多的器官。常见的肺部疾病有气胸、肺大泡、肺气肿和肺癌，肺源性心脏病、呼吸衰竭、肺栓塞、肺脓肿、肺炎、新生儿肺炎、小儿肺炎、气管炎、哮喘、肺结核、尘肺、间质性肺疾病、呼吸系统疾病等。肺部疾病比较常见，而且发起病来后果严重，甚至危及生命，例如慢性肺源性心脏病，是由于肺组织、肺动脉的原发性病变，使肺血管阻力增加，肺动脉压力升高，从而造成右心负荷加重，右心室肥大，最终导致右心功能衰竭，继而危及生命[16]。研究肺侧群细胞分化为血管内皮细胞，可以为由于肺损伤及肺疾病等引起的细胞损伤提供新的细胞，从而延缓病情。

本实验分选小鼠CD45-/CD31+肺侧群细胞，通过体外诱导分化培养，最终分化发育为血管内皮细胞。实验结果表明，CD45-/CD31+肺侧群细胞是血管内皮细胞的祖细胞，具有干细胞分化特性。这为临床干细胞的来源获取提供新途径，并且为干细胞的研究及肺部疾病的治疗研究提供新的思路。

[1]TASHKIN D P,ROTH M D,CLEMENTS P J,et al.Mycophenolate mofetil versus oral cyclophosphamide in scleroderma-related interstitial lung disease(SLSⅡ)：a randomised controlled,doubleblind,parallel group trial[J].The Lancet Respiratory Medicine, 2016,4(9)：708-719.

[2]GUYATT G H,BERMAN L B,TOWNSEND M,et al.A measure of quality of life for clinical trials in chronic lung disease[J]. Thorax,1987,42(10)：773-778.

[3]van MARTER L J,ALLRED E N,PAGANO M,et al.Do clinical markers of barotrauma and oxygen toxicity explain interhospital variation in rates of chronic lung disease[J].Pediatrics,2000, 105(6)：1194-1201.

[4]MURPHY B P,INDER T E,HUPPI P S,et al.Impaired cerebral cortical gray matter growth after treatment with dexamethasone for neonatal chronic lung disease[J].Pediatrics,2001,107(2)：217-221. [5]SUMMER R,KOTTON D N,LIANG S,et al.Embryonic lung side population cells are hematopoietic and vascular precursors[J]. American JournalofRespiratory Celland MolecularBiology, 2005,33(1)：32-40.

[6]LIANG S X,KHACHIGIAN L M,AHMADII Z,et al.In vitro and in vivo proliferation,differentiation and migration of cardiac endothelial progenitor cells (SCA1+/CD31+side-population cells)[J]. Journal of Thrombosis and Haemostasis,2011,9(8)：1628-1637.

[7]SUMMER R,FITZSIMMONS K,DWYER D,et al.Isolation of an adult mouse lung mesenchymal progenitor cell population[J]. American JournalofRespiratory Celland MolecularBiology, 2007,37(2)：152-159.

[8]LIANG S X,SUMMER R,SUN X,et al.Gene expression profiling and localization of Hoechst-effluxing CD45-and CD45+cells in the embryonic mouse lung[J].Physiological Genomics,2005, 23(2)：172-181.

[9]LIANG S X,TAN T Y L,GAUDRY L,et al.Differentiation and migration ofSca1+/CD31+cardiac side population cells in a murine myocardial ischemic model[J].InternationalJournalof Cardiology,2010,138(1)：40-49.

[10]MOSERLE L,GHISI M,AMADORI A,et al.Side population and cancer stem cells：therapeutic implications[J].Cancer Letters,2010,288(1)：1-9.

[11]BOESCH M,ZEIMET A G,FIEGL H,et al.High prevalence of side population in human cancer cell lines[J].Oncoscience,2016,3(3/4)：85.

[12]TABOR M H,CLAY M R,OWEN J H,et al.Head and neck cancer stem cells：the side population[J].The Laryngoscope, 2011,121(3)：527-533.

[13]NAKAYAMA M,OGASAWARA S,AKIBA J,et al.Side population cell fractions from hepatocellular carcinoma cell lines increased with tumor dedifferentiation,but lack characteristic features of cancer stem cells[J].Journal of Gastroenterology and Hepatology,2014,29(5)：1092-1101.

[14]YANG M,ZHANG R,YAN M,et al.Detection and characterization of side population in Ewing's sarcoma SK-ES-1 cells in vitro[J].Biochemical and Biophysical Research Communications, 2010,391(1)：1062-1066.

[15]曹志飞,李新平,陈志欣,等.边缘细胞的研究进展[J].中国药理学通报,2007,23(11)：1405-1408.

[16]应茵,黄萍,羊波.中药防治肺心病实验研究进展[J].浙江中西医结合杂志,2013,23(1)：75-78.

（童颖丹 编辑）

Differentiation of mouse CD45-/CD31+lung side population cells into endothelial cellsin vitro*

Ming-jie Zhang,Zong-ze Li,Yang Xu,Xun Liang
(Department of Biochemistry and Molecular Biology,Jinzhou Medical University, Jinzhou,Liaoning 121000,China)

ObjectiveTo investigate the characteristics of differentiation of lung side population(LSP)cells in vitro.Methods Mouse lung tissue was taken,and mouse CD45-/CD31+LSP cells were sorted by flow cytometry.Immunofluorescence was used to detect the expression of ATP-binding cassette sub-family G member 2 (ABCG2)in the isolated LSP cells.RT-PCR was applied to detect the expression ofABCG2,Tie2andvWF in mouse CD45-/CD31+LSP cells.After the LSP cells were cultured for 14 days,the expression ofvWFwas detected by immunofluorescence,and the mRNA expression ofABCG2as well asvWFof both freshly isolated LSP cells and cultured LSP cells were examined by RT-PCR.Results Flow cytometry sorted out the CD45-/CD31+LSP cells,and immunofluorescence tested that they expressedABCG2.RT-PCR results revealed that LSP cells expressedABCG2as well asSMAandTie2,but did not expressvWF.LMP highly expressed vWF.The CD45-/CD31+LSP cells expressedABCG2,but did not expressvWFbefore induction of differentiation;while the cells expressedvWFin stead ofABCG2after the induction of differentiation.Conclusions CD45-/CD31+LSP cells might be the progenitor cells of vascular endothelial cells,which possess the characteristics of stem cell differentiation,and can be differentiated into vascular endothelial cellsin vitro.

side population cell;endothelial cell;ATP-binding cassette sub-family G member 2

R329.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.06.004

1005-8982（2017）06-0017-06

2016-08-25

国家自然科学基金（No：81370619）

梁迅，E-mail：1161653758@qq.com