谢越　周成　涂从　张祖亮　汪建飞

摘要应用近红外光谱（NIRS）技术定量分析连作滁菊土壤样品中阿魏酸的含量。通过标准杠杆值、学生残差和马氏距离判断异常光谱， 经二阶导数和Norris平滑滤噪预处理后， 在6000～4000 cm

Symbolm@@ 1范围， 最佳因子数为7， 采用偏最小二乘法（PLS）构建数学模型。结果表明， 模型校正集和验证集与高效液相色谱仪（HPLC）测定的参考值之间均呈现良好相关关系， 校正相关系数Rc为0.9914， 交叉验证相关系数Rcv为0.9935， 校正集误差均方根（RMSEC）为0.484， 预测误差均方根（RMSEP）为0.539， 交叉验证误差均方根（RMSECV）为0.615。研究结果表明， NIRS分析技术能够实现连作土壤中阿魏酸的快速检测， 结果准确可靠。

关键词近红外光谱； 连作土壤； 滁菊； 酚酸； 阿魏酸

1引 言

滁菊（Chrysanthemum morifolium cv. ‘Chuju）是国家地理标志产品，也是安徽省的特色植物资源。因其含有黄酮类、多糖、多酚类等物质，具有良好的药物和食补功能，被国家卫生部批准为药食两用食物[1]。滁菊的种植已有两千多年的栽培历史，但是近年来滁菊种植出现了连作障碍现象，已经成为滁菊产业发展的制约瓶颈[2]。

研究发现，由滁菊根系分泌和残体腐解产生的酚酸类物质大量分布在连作土壤中，其产生的自毒作用是滁菊连作障碍问题的重要原因之一[3]。产生自毒作用的酚酸类物质种类很多，其中阿魏酸是一种广泛分布的酚酸，同样也常见于其它中草药连作种植土壤中[4～6]。阿魏酸在连作滁菊土壤中的含量相对较高，达到18.24 μg/g[3]，是所有检测到的酚酸物质中含量较高的一类，这使得阿魏酸成为滁菊酚酸类自毒物质的标志性物质。因此，对于阿魏酸的快速检测，成为以滁菊为代表的中草药种植过程中提前预防连作障碍问题发生的关键技术。

目前，阿魏酸的检测方法主要有高效液相色谱法[3]、反相高效液相色谱法[7]、流动注射化学发光法[8]等。这些方法通常存在前处理复杂、分析时间较长、样品容易污染等缺点。阿魏酸稳定性差， 容易分解， 使得上述检测手段无法满足实际生产过程的定量分析要求。

近红外光谱（NIRS）技术是近年来快速发展的绿色、无损分析技术，具有无需样品预处理、無二次化学污染、操作简便、快速的特点[4，9]，已广泛用于农业[10～12]、烟草[13]、食品[1]、药物[5]等行业的成分定量测定。目前，采用NIRS定量分析中草药土壤中阿魏酸的文献尚未见报道。本研究采用近红外光谱分析技术，应用偏最小二乘法构建数学模型，预测连作滁菊土壤样品中阿魏酸的含量， 为以滁菊为代表的中草药连作障碍问题的早期发现与预防提供新技术。

2实验部分

2.1仪器与试剂

Antaris Ⅱ傅里叶变换近红外光谱仪（美国Thermo公司），配液体透射检测器，采样系统以及TQ Analyst处理软件； Waters 6002487高效液相色谱仪（美国Waters公司）； MS204电子天平、FE30 pH计（梅特勒托利公司）； AB5150B超声波清洗机（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）； D101大孔树脂（国药集团化学试剂有限公司）； 阿魏酸（分析纯，Sigma公司）； 乙腈（色谱纯，德国Fisher公司）； 其余试剂均为国产分析纯试剂。实验用水为超纯水（18.2 MΩ cm2）。

2.2实验方法

2.2.1样品的制备取连作5年滁菊土壤样品，加入20倍量95%乙醇，加热回流提取2 h，提取3次，冷却，0.45 μm微孔滤膜过滤3次， 合并提取液，旋转蒸发至无乙醇味，收集浓缩液，再加入3倍量45℃温水，室温静置24 h，以4500 r/min离心20 min，上清液储存于棕色瓶中，4℃冷藏备用。D101大孔树脂先用95%乙醇浸泡过夜，用超纯水反复冲洗直至无乙醇味； 再用4% NaOH浸泡6 h，用超纯水冲洗至中性； 然后用4% HCl溶液浸泡过夜，用超纯水冲洗至中性，装柱（200 mm×50 mm）备用。 提取液用50%乙醇以20 mL/h的速度洗脱，洗脱过程中每隔一段时间收集大孔树脂富集纯化后的样品，5根树脂柱子平行操作，每根收集30个样品， 共得到150个样品。

2.2.2阿魏酸的测定阿魏酸的测定方法参考本课题组关于酚酸的分析方法[3]，略做调整。具体HPLC测定条件如下： Symmetry C18色谱柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm），柱温30℃，检测波长280 nm； 流动相为0.01% H3PO4溶液（A）和乙腈（B），以冰醋酸调节至pH 2.8，梯度洗脱： 0～10 min，95% A； 10～25 min， 85% A； 25～35 min，60% A； 35～40 min，65% A； 40～45 min，95% A。流速1.0 mL/min； 进样量10 μL。

2.2.4光谱数据处理与数学模型的建立和验证在剔除奇异样本后，随机取100份样品组成校正集，剩余样品作为验证集，验证集不参与模型构建。在光谱预处理基础上，运用偏最小二乘法，利用TQ Analyst （Thermo Nicolet Com， USA）软件，进行数据的分析，建立近红外光谱多元校正模型。通过TQ Analyst软件的分析功能剔除异常光谱，由预测残差平方和（Predicted residual error sum of squares， PRESS）结果确定所需因子数。表征近红外光谱定量模型建模效果的指标，主要有校正相关系数Rc、交叉验证相关系数Rcv， 交叉验证误差均方根（Root mean square error of crossvalidation， RMSECV）、校正集误差均方根（Root mean square error of calibration， RMSEC）和预测误差均方根（Root mean square error of validation， RMSEP），各参数计算公式如下：

3.2异常光谱的诊断

样品谱图采集过程中，由于设备本身的误差、操作的失误、波长的漂移及环境因素的变化，近红外光谱谱图可能出现异常，从而引起模型精度的降低[14]。对于异常样品的诊断，一般采用马氏距离、标准杠杆值和学生残差判断。图2为150个样品的马氏距离分布图。

从图2可见，样品马氏距离平均值为1.18，阈值为1.31，有3个样品超过阈值，其标准杠杆值和学生残差均较高，视为异常样品。

图3为样品标准杠杆值和学生残差关系图，除了超过马氏距离阈值的3个样品外，还有2个样品点的标准杠杆值和学生残差较为离群，这5个样品的标准杠杆值和学生残差都较高，所以建模前将这5个奇异样品剔除。

3.3建模光谱波段的选择

PLS法虽然可以全波段建立数学模型，但是如果建模波段选择过宽，必然包含有过多冗余信息，不利于模型预测的精确度[17]。依据TQ Analyst软件推荐的模型构建波段范围，以及样品阿魏酸特征波段的相关关系，建立了不同波段范围内阿魏酸的PLS定量数学模型，结果见表1。

Rc值越接近1，模型越精确。RMSEC和RMSECV值越小，越可有效消除测试样品之间差别造成的光谱基线漂移和偏移。 RMSEC和RMSEP值越小，且两者数值接近，意味着模型更穩定，预测性能更好[18]。从表1可知，在不同近红外波段范围内，对模型参数的影响程度不同。通过比较，发现在6000～4000 cm范围，主因子数为7，采用PLS法构建数学模型，校正集和HPLC测定的参考值之间的相关关系见图 5，验证集与参考值之间的相关关系见图6。校正集和验证集与HPLC的参考值之间均呈现良好相关关系，校正相关系数Rc为0.9914，交叉验证相关系数Rcv为0.9935，校正集误差均方根RMSEC为0.484，预测误差均方根RMSEP为0.539，交叉验证误差均方根RMSECV为0.615。

实验结果表明，以PLS法建立的近红外数学模型预测连作滁菊土壤中的阿魏酸含量，所得结果与HPLC的测定结果吻合程度好，准确可靠。因此，NIRS分析技术能够实现连作土壤中阿魏酸的快速准确检测。

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AbstractA near infrared spectroscopy （NIRS） method was used for rapid quality evaluation of ferulic acid content in chrysanthemum morifolium cv. （Chuju） continuous cropping soil. Standard leverage， studentized residual and Mahalanobis distance were calculated to eliminate abnormal samples. After the initial near infrared spectrum was treated by two second derivative and Norris smoothing filter noise， 6000-4000 cm 1 wave number range and 7 factors were chosen for partial least squares （PLS） calibration model. The results showed that good correlation was presented between the calibration set/validation set and the values determined by high performance liquid chromatography， and the calibration correlation coefficient （Rc） and validation correlation coefficient （Rcv） were 0.9914 and 0.9935， respectively. Root mean square error of calibration （RMSEC）， root mean square error of validation （RMSEP） and root mean square error of crossvalidation （RMSECV） were 0.484， 0.539 and 0.615， respectively. This method was accurate， reliable， simple， rapid and nondestructive， and could be applied to the fast analysis for ferulic acid in continuous cropping soil.

KeywordsNear infrared transmittance spectroscopy； Continuous cropping soil； Chrysanthemum morifolium cv. （Chuju）； Phenolic acids； Ferulic acid