刘卓　李洪军　李晓鸥　杨照微　赵丽纯　黄丽红　郭宏华　王海　赵晴　何成彦

摘要通过凝胶电泳将大肠癌患者的手术标本组织（肿瘤与癌旁）中的总蛋白按照分子量分成不同的组分，经胶内水解后，利用毛细管液相色谱质谱联用技术对各个组分的多肽混合物进行蛋白质组学分析，共鉴定出29种差异表达的蛋白质，其中肿瘤组织中表达上调的蛋白质19种，如Fibrinogen beta chain，Vimentin，Fibrinogen gamma chain，Histone H2A type 1B/E，Isoform 1 of Periostin，Fibrinogen alpha chain，Histone H3.1，Alphaenolase，Protein disulfideisomerase A3等； 在肿瘤组织中表达下调的有10种蛋白质，如Sarcomeric tropomyosin kappa，Transgelin，Heat shock protein beta1，Talin1，Isoform 2 of Vinculin，Isoform 1 of FilaminC等。通过蛋白质印迹实验对其中的踝蛋白1（Talin1）和烯醇化酶（Alphaenolase）的蛋白质组学鉴定结果进行了验证。生物信息学分析表明在大肠癌组织中表达上调的蛋白多具有胞外分泌的属性，提示这些蛋白很有可能会渗透到机体内的循环系统中，从而在患者血液或者腹水中能够被检测到； 而在大肠癌组织中表达下调的蛋白则多为细胞骨架、胞外基质纤维等的组成成分，这些蛋白的下调常与肿瘤细胞向周围组织的侵袭和转移有密切关系。本研究为大肠癌的早期诊断、大肠癌初筛等方面的研究等提供了基础数据，对进一步深入研究大肠癌发病机制具有重要意义。

关键词凝胶电泳毛细管液相色谱质谱； 大肠癌； 蛋白质组； 踝蛋白1； 烯醇化酶1

1引 言

近年来，随着我国人民生活水平的提高和饮食结构的变化， 大肠癌的发病率和死亡率均有逐年上升的趋势[1]，其发病机制相当复杂，受环境中物理、化学、生物学的因素和机体中遗传、内分泌、免疫等因素共同诱发和影响[2，3]。因此，对大肠癌发生发展过程中所涉及的生物大分子尤其是蛋白质进行全面整体的分析成为深入研究其内在复杂机制的一种重要策略。目前，研究者已对多种人类肿瘤组织或细胞系包括大肠癌中开展了蛋白质组学研究，并取得了一系列成果。 Giusti等[4]通过二维（2D）电泳分离结合质谱分析，在大肠癌患者的肠道灌洗液中发现了38种肿瘤相关蛋白； Hammoudi A等[5]通过二维色谱 （2DLC）技术研究小鼠的小肠上皮细胞经APC基因敲除的蛋白质组变化，发现了81个表达升高的蛋白，生物信息学分析显示其中9种蛋白有可能在血液循环系统中被检测到； Yamamoto等[6]利用毛细管液相色谱质谱联用技术分析了甲醛固定石蜡包埋的结直肠病理组织中癌症区域和非癌症区域的蛋白质差异，发现Cyclophilin A， Annexin A2， 和Aldolase等蛋白在癌症区域的表达明显升高。越来越多的证据表明，大肠癌的发生发展涉及到多个癌基因和抑癌基因的改变，表现为多基因、多步骤的协同累积作用。因此，使用具有多种不同维度、不同机理的分离和前处理手段， 尽可能使复杂样品混合物得到有效地分離，包括在蛋白和多肽两种水平上对复杂组织样品进行全面分析，能够得到更全面深入的样品蛋白的种类和组成分布特征等信息。

作为一种高通量的蛋白质研究方法，蛋白组学的研究对象常常是成百上千种蛋白质，以及蛋白质的不同的修饰状态[7，8]。因此，蛋白质组学研究几乎都首先涉及到对蛋白质、多肽的不同程度的分离， 因此需不断完善和发展相关的蛋白质与多肽分离技术[9，10]。相对于传统的二维凝胶电泳技术，目前发展了二维色谱 （2DLC）、二维毛细管电泳 （2DCE）、液相色谱毛细管电泳 （LCCE） 、凝胶电泳毛细管液相色谱（GelCapLC）等新型分离技术。这些技术与质谱联用，能够直接、全面地对复杂样品中蛋白质组进行分析鉴定，其中， 基于凝胶电泳毛细管液相色谱质谱的联用技术已广泛地应用在蛋白质组学的各个领域。该技术首先将蛋白质混合物经凝胶电泳分离，再将分离后的蛋白质条带剪切后分别进行胶内水解，得到肽段混合物再进行毛细管液相色谱分离。这种策略整合了蛋白质水平的分离（凝胶电泳）和多肽水平的分离（毛细管液相色谱）， 分离效率大为提高， 操作相对简单， 已逐渐发展成为复杂蛋白质组样品的主流分离技术[11，12]。

本研究通过凝胶电泳毛细管液相色谱质谱联用技术， 对4名大肠癌患者的手术标本组织（肿瘤与癌旁）进行了全面的蛋白质组学分析，鉴定出差异表达的蛋白质，并对蛋白质组学实验结果进行了生物信息学分析。本研究对于大肠癌的病因、发病机制、临床诊断、治疗以及预防等方面的研究具有重要意义。

2实验部分

2.1仪器与试剂

EasynLC 1000纳升液相色谱系统、Q Exactive质谱仪、Varioskan酶标仪（美国Thermo Scientific公司）； PepMap100 C18反相毛细管色谱分析柱（150 mm×0.075 mm， 3μm， 美国Thermo Fisher Dionex公司）； Allegra TM X22R离心机（美国Beckman Coulter公司）； 离心干燥机（德国Christ公司）。

二硫苏糖醇、测序级TPCK修饰的胰蛋白酶、苯甲基磺酰氟 （PMSF）（Promega公司）； 鼠抗人踝蛋白抗体、鼠抗人烯醇化酶抗体、兔抗人GAPDH（Glyceraldehyde3phosphatedehydrogenase）抗体（Santa Cruz公司）； 尿素（Urea）、三羟甲基氨基甲烷 （Tris base）、Bradford蛋白定量试剂盒、碳酸氢铵、碘乙酰胺（BioRad公司）； 磷酸酶抑制剂、ZipTip C18吸头（Pierce公司）； 甲酸、乙腈 （Sigma公司）； 其它试剂均为国产分析纯。实验用水为经MilliQ纯水仪制备的超纯水。

2.2临床样本取材

本实验所用4例新鲜组织标本取自吉林大学中日联谊医院就诊并手术治疗的大肠癌患者。病人术前均未接受任何治疗。所取癌旁正常组织均为距离癌边缘10 cm之外， 切缘正常组织，并且均位于癌组织上端。标本离体后，使用生理盐水冲洗表面残余血液，立即放入液氮冷冻，再置于80℃保存。另取少量组织标本进行石蜡包埋、切片、HE常规染色，经病理学检查证实组织类型，均是Ⅲ期腺癌。

2.3样品总蛋白提取、蛋白浓度分析及电泳分离

2.4蛋白质样品的还原、烷基化和胶内水解

用洁净的刀片将蛋白条带切取后，再切成1 mm3左右的颗粒，用脱色液（15 mmol/L K3[Fe（CN）6]，50 mmol/L Na2S2O3）将颜色完全脱除。用25 mmol/L NH4HCO3清洗胶粒3次后， 用乙腈脱水，室温自然干燥。加入1 mol/L DTT溶液，充分混匀，使其终浓度为20 mmol/L； 在56℃条件下还原1 h； 反应物温度降至室温后，加入1 mol/L碘乙酰胺溶液，充分混匀，使其终浓度为50 mmol/L，在常温下避光反应30 min； 按1∶50 （w/w）比例加入测序级胰酶， 37℃放置过夜； 酶切后样品经真空抽干后

2.5毛细管液相色谱与质谱联用分析与数据库检索

所有干燥的多肽样品均溶解在流动相A（99%水+1%乙腈+0.1%甲酸）中，以 2 μL/min的流速上样到 C18预柱（20 mm×0.075 mm， 3μm）上，以 流动相A淋洗脱盐 10 min。再以流动相A和B（B： 99%乙腈+1%水+0.1%甲酸）进行梯度洗脱（0～30 min， 5%～35% B； 30～ 40 min， 35%～80% B），流速为300 nL/min。洗脱出的多肽经纳升喷雾离子源进入Q Exactive质谱进行分析。质谱扫描方式为数据依赖的采集工作模式（DDA），母离子分辨率为65000，子离子分辨率为16500。每次全扫描后最多采集15个碎片图谱。归一化碰撞能量为28% HCD。将采集到的质谱数据传输到数据处理工作站，并使用Thermo Proteome Discoverer 1.1质谱数据分析软件，在国际蛋白质索引中的人类数据库（International Protein Index）进行检索。检索参数：胰蛋白酶（Trypsin）， 最多允许2个漏切位点，母离子允许最大误差为15 ppm，子离子允许最大误差为0.8 Da，半胱氨酸（Cys）烷基化为固定修饰，丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）、酪氨酸（Tyr）的磷酸化以及甲硫氨酸（Met）的氧化为可变修饰。SEQUEST检索后将肽段可信度参数（Peptide confidence）设为高（High），对所得结果进行筛选，根据每个蛋白所匹配的谱图数评价其丰度。

2.6蛋白印迹

将2.3节中各个蛋白样品与上样缓冲液煮沸5 min，进行12% 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。将电泳分离的蛋白条带电转移到PVDF 上， 分别用抗烯醇化酶和抗踝蛋白的单克隆抗体杂交后， 加入相应的HRP标记二抗，以ECL增强化学发光法显色。同时，使用抗GAPDH的抗体对样品中的内源性GAPDH进行检测，作为内参。

2.7生物信息學分析

将在大肠癌组织中鉴定出的上调和下调的蛋白质上传到基因本体论（http：//geneontology.org/）网站，按照不同的细胞组分（Cell Components）进行富集分类。

3结果与讨论

3.1组织总蛋白质的提取、蛋白浓度测定及电泳分离

将4例大肠癌患者的肿瘤组织与癌旁组织从冰箱中取出，分别在液氮中研磨粉碎后，使用裂解缓冲液提取总蛋白质。用Bradford蛋白定量试剂盒对蛋白样品进行考马斯亮蓝染色，经酶标仪检测并计算肿瘤与癌旁组织蛋白浓度。样本病理信息、组织重量、制备总蛋白的体积和浓度见表1。

3.2大肠癌肿瘤组织与癌旁组织差异表达蛋白的鉴定

将肿瘤组织与癌旁组织总蛋白经SDSPAGE分离后得到的不同分子量的共56个组分的酶解产物进行液相色谱与质谱联用分析，得到酶解混合物的多肽质谱数据，经数据库检索得到各个组分的肽段和蛋白的鉴定信息（表2）。将各个组分的肽段和蛋白结果分别进行合并，得到各个样本的肽段和蛋白的结果。从肽段和蛋白的数量可知，4组8个样本的肽段种类在21635～26937之间，蛋白种类在4157～5024之间（图2）。

采用谱图计数法，即根据鉴定蛋白的二级质谱图数目与蛋白丰度呈一定的正相关的原理，对蛋白质组学数据进行定量分析，找出差异蛋白。 通常，样品中某蛋白质的丰度越高，则酶切产生的肽段也会越多，经质谱分析所匹配的二级谱图数也会越多[13，14]。这是基于谱图计数无标记定量方法的基础，研究者尝试利用谱图计数作为一种简单的方法对蛋白质进行相对定量分析。谱图计数

（Spectral counts，SpC）模型通过直接统计蛋白质所有肽段的二级谱图数总和来反映蛋白质丰度。

在鉴定出每一位患者手术标本组织的差异表达蛋白的基础上，再鉴定所有在4位患者手术标本中都具有显著差异的蛋白质。结果表明，共有29种差异表达蛋白，其中19种蛋白在肿瘤组织中表达上调，10种蛋白在肿瘤组织中表达下调（表3）。

3.3部分差异蛋白的蛋白印迹验证

在鉴定出的29种有显著差异蛋白质中，挑选感兴趣的蛋白（踝蛋白和烯醇化酶）进行蛋白印迹实验（图3）。结果表明， 踝蛋白在癌组织中表达明显低于癌旁组织，而烯醇化酶在癌组织中表达明显高踝蛋白（Talin） 是一种主要分布在细胞基质和细胞间质的细胞骨架蛋白质，能够将细胞骨架肌动蛋白与整合素相连接，从而促进稳定黏着斑的形成[15]，与恶性肿瘤的发生、侵袭和转移密切相关[16]。在前期研究工作中， 本研究组利用毛细管反向高效液相色谱和质谱联用技术， 分析了人大肠癌组织中的踝蛋白，鉴定了踝蛋白分子中的10个磷酸化修饰位点[17]。在本研究中进一步证实，大肠正常癌旁组织中踝蛋白的表达水平明显高于大肠原发癌组织。

在本研究组的前期工作中发现，在血液肿瘤白血病耐药细胞中烯醇化酶（Enolase）有非常高的上调[18]。而烯醇化酶能够催化2磷酸甘油酸（2Phosphoglycerate）转化为磷酸烯醇式丙酮酸（Phosphoenolpyruvate），这表明肿瘤细胞在有药物等外界压力因素的环境中，通过加快细胞内糖酵解的速率而加大肿瘤细胞对葡萄糖的利用率，从而满足肿瘤细胞所需的更多的能量消耗。本研究结果进一步证实，大肠原发癌组织中烯醇化酶的含量明显高于正常癌旁组织，提示肿瘤组织中糖酵解途径的活跃程度明显升高。

3.4差异蛋白的细胞组分的分类

对通过蛋白质组学技术鉴定到的大肠癌组织差异表达蛋白进行了生物信息学分析（图4）。结果表明，在大肠癌组织中上调的蛋白多数具有胞外分泌的属性，提示这些蛋白很可能会渗透到机体内的循环系统中，从而在患者血液或者腹水中被检测。上调蛋白的这种特点非常有利于在临床检验研究中发展相关蛋白的体液分析方法，进一步研究这些蛋白作为大肠癌肿瘤生物标志物的可行性。而在大肠癌组织中下调的蛋白则多为细胞骨架、胞外基质纤维等的组成成分，这些蛋白的下调常预示着细胞间质密度变小，有利于肿瘤细胞向周围组织的侵袭和转移[16]。

4结 论

本研究通过凝胶电泳毛细管液相色谱质谱联用技术对4名大肠癌患者的手术标本组织（肿瘤与癌旁）进行了全面的蛋白质组学分析，共鉴定出29种差异表达的蛋白质，其中在肿瘤组织中表达上调的蛋白质19种，表达下调的蛋白质10种。通过蛋白质印迹实验对其中的踝蛋白和烯醇化酶进行了验证。生物信息学分析表明，在大肠癌组织中上调的蛋白多数都具有胞外分泌的属性，而下调的蛋白则多为细胞骨架、胞外基质纤维等的组成成分。本研究为大肠癌的早期诊断、大肠癌初筛等方面的研究提供了基础数据，对进一步深入研究大肠癌发病机制具有重要意义。

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AbstractThe whole protein extracts from tissue specimens （tumor and noncancerous） from patients with colorectal cancer were divided into several fractions with different molecular weight by gel electrophoresis， which were then subject to ingel digestion and proteomics analysis by capillary liquid chromatographymass spectrometry. A total of 29 differentially expressed proteins were identified， among which 19 were upregulated proteins in tumor tissues， such as Fibrinogen beta chain， Vimentin， Fibrinogen gamma chain， Histone H2A type 1B/E， Isoform 1 of Periostin， Fibrinogen alpha chain， Histone H3.1， Alphaenolase， Protein disulfideisomerase A3， and so on. Ten proteins were found to be downregulated， including Sarcomeric tropomyosin kappa， Transgelin， Heat shock protein beta1， Talin1， Isoform 2 of Vinculin， Isoform 1 of FilaminC， and so on. The differential expressions of Talin1 and Alphaenolase were selected to be verified by Western blot analysis. Bioinformatics analysis results indicated that most of the upregulated proteins in colorectal cancer tissues had the feature of protein exocytosis， suggesting that these proteins were likely to penetrate into the circulatory system in the body， which could be detected in blood or ascites. On the other hand， most of the downregulated proteins belonged to the cytoskeleton and extracellular matrix fibers， which were closely related to the invasion and metastasis of tumor cells into their surrounding tissues. This study provided basic data for the early diagnosis of colorectal cancer， colorectal cancer screening and other aspects， which had important significance to further study the pathogenesis of colorectal cancer.

KeywordsGel electrophoresiscapillary liquid chromatographymass spectrometry； Colorectal cancer； Proteome； Talin 1； Enolase 1