刘宇飞　薛金涛　闫慧娟　杨丽娟　刘巍　孙祥德

摘要将核酸外切酶Ⅲ诱导的双重信号放大技术与MoS2纳米片的荧光猝灭性质结合，构建了一种高灵敏高选择性的DNA检测方法。首先设计两条末端修饰荧光基团的探针核酸（HP1和HP2）。由于两条探针核酸具有3′粘性末端， 使其不会被核酸外切酶Ⅲ降解，因而被吸附于MoS2纳米片而猝灭其荧光。当目标DNA存在时，会促使核酸外切酶Ⅲ启动双重信号放大反应，并将探针核酸降解成大量的不能吸附于MoS2纳米片表面的荧光碎片。在优化条件下，目标DNA浓度在0.5～6.0 pmol/L范围内与荧光信号变化呈良好的线性关系，检出限为0.28 pmol/L。与单重信号放大技术相比，本方法极大改善了分析灵敏度和检出限，且具有良好的单碱基错配区分能力。

关键词DNA传感器； MoS2纳米片； 核酸外切酶Ⅲ； 双重信号放大； 荧光猝灭

1引 言

特定序列核酸的检测在病原感染、遗传疾病、法医鉴定以及现代生命科学发展等方面具有重要作用[1～5]。发展灵敏度高、准确性好且简单、快速的核酸检测方法仍然是目前生物分析研究的热点[6，7]。目前，许多信号放大技术已广泛应用于DNA检测中，诸如核酸外切酶Ⅲ（Exonuclease Ⅲ， Exo Ⅲ）诱导的信号放大[8～10]、DNA聚合酶诱导的信号放大[11～13]、杂交链式反应的信号放大[14～17]及滚环复制诱导的信号放大[18～22]等。其中，Exo Ⅲ能够无序列选择性地将双链DNA的3′末端剪切成单核苷酸，因而成为一种极为常用的信号放大工具[23，24]。Exo Ⅲ这种独特的性质使其广泛应用于核酸[8～10，23，24]、蛋白质[25，26]及其它物质[27，28]检测中。Cai等[10]开发出了一种基于Exo Ⅲ的双重放大技术，用于核酸检测。与单重信号放大技术相比， 该方法极大提高了检测灵敏度，并有较好的碱基错配分析能力。

MoS2纳米片是一种与石墨烯具有类似结构的二维纳米材料，其独特的纳米电子学性质、光电子性质及电子捕获能力使其成为重要的能量转移受体[29，30]。与石墨烯相比，MoS2纳米片更易于大规模制备， 且无需处理即可直接分散于溶液中[31，32]。同时，MoS2纳米片可与荧光染料修饰的单链核酸结合并猝灭其荧光。这一独特性质使其能够用于构建快速、高灵敏且低成本的生物传感器[33～35]。然而，基于MoS2纳米片的生物分析方法仍然较少[36]。

原发性血色病是一种常染色体隐性遗传疾病，致使铁调节相关激素的缺陷，造成胃肠道过度吸收铁，随后沉积在肝脏、胰腺、心脏、关节、皮肤和性腺，最终引起各器官功能的损害，而在人类遗传性血色病中，HFE基因蛋白的突变是最常见的原因[37]。本研究将Exo Ⅲ诱导的双重放大技术与MoS2纳米片的荧光猝灭性质相结合，用于人血色病（Human hemochromatosis， HFE）特异性序列的检测中。当目标DNA存在时，会促使Exo Ⅲ启动双重放大反应，对两条发夹结构的荧光探针核酸（Hairpin probe 1 and hairpin probe 2， HP1 and HP2）降解，并产生大量荧光基团碎片，且这些碎片因不能吸附于MoS2纳米片表面而使其荧光恢复。本方法由于引入MoS2纳米片，不仅降低了检测背景，且极大降低了荧光探针的用量，进而降低了检测成本。

2实验部分

2.1仪器与试剂

RF5301PC 型荧光光谱仪（日本Shimadzu 公司），激发波长480 nm，激发和发射狭缝宽度均为10 nm。 PB10 酸度计（德国Sartorius公司）。SPA400原子力显微镜（AFM），SPI3800控制软件（日本Seiko Instruments Industry公司）。JEM1200EX透射电子显微镜（TEM，日本电子公司）。

缓冲溶液由20 mmol/L Tris， 300 mmol/L NaCl和10 mmol/L MgCl2配制，并用HCl调节至pH 8.0； MoS2纳米片（南京先丰纳米科技公司）； Exo Ⅲ（Takara公司）； 其它试剂均为分析纯； 实验用水均为去离子水； 所有核酸均由上海生物生工有限公司合成，其序列见表1。

2.2样品检测

将2.0 nmol/L HP1、8.0 nmol/L HP2、待测样品和Exo Ⅲ混合，并用缓冲液补足至200 μL，并在37℃下孵育一段时间后，加入适量MoS2纳米片，并用缓冲液补足至400 μL。在激发波长为480 nm，发射波长为520 nm的条件下，测定上述溶液的荧光强度。所有实验均重复3次。

3结果与讨论

3.1实验原理

本方法的检测原理如图1所示：首先设计两条发夹结构的探针核酸HP1和HP2，其序列见表1，HP1和HP2的序列有互补的部分，但两者均为自杂交的分子信标结构，且互补部分主要存在于分子信标的茎部分，因而HP1和HP2不会相互杂交。当没有目标DNA时，HP1和HP2各自保持其分子信标结构，两者3′粘性末端又防止了Exo Ⅲ的降解，因而HP1和HP2会被吸附于MoS2纳米片表面，荧光信号被猝灭。当体系中存在目标DNA时，目标DNA与HP1杂交，HP1的3′末端成为双链结构，从而诱使Exo Ⅲ对HP1进行降解。在降解过程中，会产生荧光碎片基团和HP1中的T1序列（黑色加粗部分），且目标DNA从杂交复合体中重新释放，并与另一个HP1分子杂交，重新开启酶切反应。在第二步放大反应中，由上一步反应产生的T1与HP2杂交，并诱导Exo Ⅲ对HP2进行降解，进而产生另一部分荧光碎片，并使T1从杂交复合物中释放。再与另一个HP2分子杂交，进入下一个循环反应。这样，少量的目标DNA就能够诱导两个信号放大反应的发生，从而产生大量荧光碎片，而这些荧光碎片因不能吸附于MoS2表面而使其熒光得以恢复。通过荧光信号的变化，即可对目标DNA进行定量检测。

3.2MoS2納米片的表征

MoS2纳米片的特征结果如图2所示。通过原子力显微镜成像（图2A）可见，MoS2纳米片的高度侧面约1.5 nm。从透射电镜图（图2B）可见，MoS2纳米片能够较稳定地均匀分散于在溶液中。

3.3可行性实验

可行性实验结果如图3所示，当体系中没有目标DNA时（a），由于探针核酸HP1和HP2均为发夹结构不能相互杂交，且Exo Ⅲ只能对3′末端为双链结构的核酸降解，不能对3′末端为粘性的核酸降解， 因而大量的探针核酸仍保持单链结构，且吸附于MoS2纳米片表面，体系的荧光强度非常微弱。

当体系当中没有Exo Ⅲ时（b），目标DNA只能与少量HP1杂交，大量探针核酸（HP1和HP2）仍会被MoS2纳米片吸附，而是其荧光猝灭。只有当目标DNA和Exo Ⅲ同时存在时（c， d， e），目标DNA才会与HP1杂交成双链结构，双重放大反应得以启动，大量探针核酸被降解成单核苷酸碎片，荧光基团被释放，且难以吸附于MoS2纳米片表面，荧光强度明显增强，且随目标DNA浓度升高，荧光信号逐渐增强。说明这种荧光传感器的设计可以实现目标核酸的信号放大检测。

3.4条件优化

为获得最佳检测结果，对检测体系中MoS2纳米片浓度、Exo Ⅲ用量及检测时间进行优化。

MoS2纳米片浓度对HP1和HP2的荧光强度的影响见图4，随着MoS2纳米片浓度增大，HP1和HP2的荧光强度逐渐降低。当MoS2纳米片浓度在0～1.8 μg/mL范围内变化时，荧光强度呈线性下降； 当MoS2浓度继续增大时，荧光强度继续下降，但下降幅度减少； 当MoS2纳米片的浓度超过3.6 μg/mL时，荧光强度变

化很小，因而MoS2纳米片浓度选取为3.6 μg/mL。

ExoⅢ是体系中信号放大因子，因而需要对其进行考察。随着Exo Ⅲ活力增大，荧光强度逐渐增强。当活力超过45 U时，荧光强度增强的幅度逐渐趋向平缓，当活力超过60 U时，荧光强度虽仍有增加，但增强幅度较少，为节省成本且保证检测效果，后续实验活力选择为60 U。

酶反应时间是影响酶反应效果的重要参数。考察酶反应时间对本体系的影响。随着反应时间延长，检测信号逐渐增强，当达到50 min时，酶反应逐渐趋于平稳，达到80 min时，荧光强度变化微弱，说明反应已经达到平衡。为保证酶反应充分和检测效率，选取80 min为最佳反应时间。

3.5目标DNA的标准曲线及检出限

在上述优化的实验条件下，对目标DNA进行定量检测。从图5可见，荧光强度随着目标DNA浓度的增大而增强，表明荧光强度与目标DNA的浓度呈线性关系。

在0.5～6.0 pmol/L范围内，荧光强度与目标DNA浓度之间具有良好的线性关系，拟合回归方程为y=84.84x+64.74（R2=0.9860），其中，y为荧光强度，x为目标DNA浓度（pmol/L），检出限（3σ， n=11）为0.28 pmol/L。相较于其它HFE信号放大检测方法[10，38]，本方法具有更低的检出限。由于引入MoS2纳米片，本方法中探针核酸无需修饰猝灭基团，且探针使用量更低，极大节省了检测成本。

3.6选择性实验

为验证本方法对目标DNA的特异性，选取目标DNA与错配一个和两个碱基的序列进行比较。由图6可见，本方法能够明显区分目标DNA与碱基错配序列。

在浓度相同的情况下，单碱基错配的荧光强度仅为目标DNA的21.0%，而两个碱基错配序列的荧光信号则只有目标DNA的15.6%。说明本方法能够很好地区分碱基错配序列，具有良好的选择性。

3.7实际样品分析

考察本方法在复杂样品中的检测能力。在1%的空白血清样品中，加入不同浓度的目标核酸，线性结果如图7所示，在1%的空白血清样品中，检测信号依然与目标核酸呈良好的线性关系，表明本方法可以应用于稀释后的血清样品分析，具有较好的抗干扰能力。

4结 论

建立了一种基于Exo Ⅲ诱导的双重信号放大与MoS2纳米片荧光猝灭能力的新型核酸探针。本方法具有高灵敏、高选择性且成本低的优点。本方法具有通用性， 将探针的序列改变，则可以应用到其它DNA的检测当中。

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AbstractA highly sensitive and selective DNA biosensor is described based on the fluorescence quenching ability of MoS2 nanosheet and exonuclease Ⅲ （Exo Ⅲ） assisted dualsignal amplification. In this sensor， the fluorescence probes （HP1 and HP2） cannot be degraded by Exo Ⅲ due to the 3′termini protrusion and thus are adsorbed on the surface of MoS2 nanosheets， which will result in the quenching of MoS2 nanosheets toward the probes and induce a low fluorescent signal. The presence of the target DNA leads to the desorption of probes on the surface of MoS2 nanosheets due to the hybridization toward probes， generating many fluorescent fragments by Exo Ⅲ digestion and inducing dualsignal amplification. This method can improve the sensitivity and detection limit compared with single amplification method， and shows excellent selectivity in the discrimination of single base mismatched targets. On the basis of the significantly high sensitivity， the developed biosensor can be potentially extended to detect various DNA targets with excellent sequence selectivity.

KeywordsDNA sensor； Molybdenum disulfide nanosheet； Exonuclease Ⅲ； Dualsignal amplification method； Quenching ability