林品言

（湖南省常德市畜禽水产品质量安全检验检测中心，湖南常德415000）

高效液相色谱法检测生鲜乳中三聚氰胺

林品言

（湖南省常德市畜禽水产品质量安全检验检测中心，湖南常德415000）

文章建立了紫外检测器—高效液相色谱法测定生鲜乳中三聚氰胺的方法。经过阳离子交换固相萃取柱净化后的样品采用高效液相色谱法测定。采用C18色谱柱，以离子对试剂缓冲液—乙腈（85:15）为流动相，流速为1.0 mL/min，检测波长为240nm，柱温为40℃。结果表明，三聚氰胺在1.0～100μg/mL的浓度范围呈良好的线性关系。三聚氰胺的标准曲线为y=82422x+64465，相关系数r为0.9997，回收率在91.7%～103.4%之间，方法检出限为0.3mg/kg，方法的定量限约为1.0 mg/kg。该方法具有操作简单，灵敏高，重复性好，回收率高等优点，可用于生鲜乳中三聚氰胺的分析测定。

生鲜乳；三聚氰胺；高效液相色谱法

三聚氰胺化学式为C3H6N6，俗称密胺，蛋白精，它是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，被用作化工原料。它是白色单斜晶体，几乎无味，微溶于水。可溶于甲醇、甲醛、乙酸等，不溶于丙酮、醚类、对身体有害，不可用于食品加工或食品添加物[1]。然而由于三聚氰胺分子中含有大量的氮元素，而传统的“凯氏定氮法”测食品中的蛋白质含量时很难区分这类伪蛋白氮的存在，2008年国内三鹿奶粉事件的曝光，均是由于违法添加三聚氰胺所致，给广发人民群众的健康造成了很大的危害，引起了社会各界对奶制品安全的关注。

目前食品中三聚氰胺的检测方法主要有：高效液相色谱法[2]、气相色谱—质谱联用法[3～4]、液相色谱—质谱联用法[5]、毛细管电泳法[6]、酶联免疫法[7]以及电化学检测法[8～9]等。本文采用高效液相色谱法紫外检测器测定生鲜乳中三聚氰胺含量，操作步骤简单，准确度、灵敏度高。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

LC-20A高效液相色谱仪（日本岛津）；紫外检测器；CP153C电子天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司；XW-80A微型旋涡混合仪：上海沪西分析仪器厂有限公司；GP-125BE干燥培养箱：天津市泰斯特仪器有限公司；TG16K-II高速离心机：长沙东旺实验仪器有限公司；摩尔原子超纯水：上海摩勒科学仪器有限公司；DL-01抽滤装置；12道SPE固相萃取装置；量筒；容量瓶；具塞离心管。

1.2 药品与试剂

三聚氰胺溶液标准物质（1.00mg/mL）：北京海岸鸿蒙标准物质技术有限责任公司；乙腈（色谱纯）：上海安谱；甲醇（色谱纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；柠檬酸（分析纯）：湖南汇虹试剂有限公司；辛烷磺酸钠（色谱纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；氨水（分析纯）：重庆川东化工（集团）有限公司；三氯乙酸（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；

1.3 溶液的配制

三聚氰胺标准工作液：取三聚氰胺溶液标准物质适量，分别用流动相稀释成 1、10、25、50、100μg/mL的一系列标准工作液（使用时现配）。

离子对试剂缓冲液：准确称取2.10g柠檬酸和2.16g辛烷磺酸钠，加入约980mL水溶解，用20g/L柠檬酸溶液调节pH至3.0后，定容至1L备用。

三氯乙酸溶液：准确称取10g三氯乙酸于1L容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混合后备用。

氨化甲醇溶液：准确量取5mL氨水和95mL甲醇，混匀后备用。

1.4 色谱条件

色谱柱：C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；流速：1.0mL/min；流动相：离子对试剂缓冲液:乙腈=85:15；检测波长：240nm；进样量：20μL；柱温：40℃。

取25μg/mL三聚氰胺标准溶液，按上述色谱条件进行高效液相色谱分析，标准色谱如图1所示。

图1 三聚氰胺标准样品色谱图

图1中12.013min为三聚氰胺色谱峰，可以看出三聚氰胺有较好的分离，峰形尖锐，对称性好。

1.5 样品前处理

称取2g（精确至0.01g）生鲜乳于50mL具塞塑料离心管中，加入15mL三氯乙酸溶液和5mL乙腈，超声提取10min，再振荡提取10min，以不低于4000r/min离心10min。上清液经三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，用三氯乙酸溶液定容至25mL，移取5mL水混匀后做待净化液。

用PCX阳离子交换固相萃取柱净化：（1）活化及平衡：按顺序加入3mL甲醇、3mL水。（2）上样：加入待净化液。（3）按顺序加入3mL水、3mL甲醇，吹干，弃去流出液。（4）洗脱：加入6mL5%的氨化甲醇。收集洗脱液于离心管中，在50℃下用氮气吹干。残留物用1 mL流动相定容，涡旋混合1min，测样前过0.2μm微孔滤膜。供HPLC测定。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线

以三聚氰胺标准溶液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，如图2所示。得到标准曲线回归方程：y=82422x+64465，相关系数 r为0.9997。结果表明，三聚氰胺在1.0～100μg/mL的浓度范围呈良好的线性关系。

图2 三聚氰胺标准曲线

2.2 精密度和回收率实验

结果见表1，在选定的实验条件下，加入3个不同浓度的牛奶三聚氰胺测定添加回收率，对每个样品重复测定3次，从实验结果中可以看出：最低回收率为91.7%，最高为103.4%，相对标准偏差（RSD）≤3.48%。

表1 生鲜乳中三聚氰胺的回收率及相对标准偏差

2.3 灵敏度的测定

将适量浓度的三聚氰胺标准液添加到空白生鲜乳中，按1.5项的方法处理后进行色谱分析，每组样品平行测定5次，按3倍信噪比计算，方法检出限为0.3mg/kg（方法的定量限约为1.0 mg/kg）。

2.4 样品检测结果

对常德地区的三个地区的9个生鲜乳样用建立好的高效液相色谱法进行检测，测得结果如表2所示。结果表明，该9个生鲜乳中所含的三聚氰胺含量均符合国家限量标准。

表2 生鲜乳中三聚氰胺的测定结果

3 结论

本文采用阳离子交换固相萃取净化样品，离子对试剂缓冲溶液：乙腈85:15为流动相的高效液相色谱-紫外检测器检测生鲜乳中三聚氰胺含量。该方法操作简单、灵敏度和精密度高、检测线性范围宽，加标回收率良好，能够满足实验室的生鲜乳三聚氰胺检测的需要。□

[1]王士伟，邓光辉，屈忠凯，等.毛细管电泳电化学发光法分离测定奶粉中的二聚氰胺和三聚氰胺[J].分析试验室，2014,33(10):1198-1201.

[2]邸万山.高效液相色谱内标法测定奶粉中三聚氰胺[J].中国酿造，2016,35(3):145-147.

[3]董伟峰，张翠芬，陈溪，等.气相色谱串联质谱法测定奶粉，液态奶及鸡蛋中三聚氰胺的含量[J].食品研究与开发，2010,31(1):116-118.

[4]洗燕萍，郭新东，罗海英，等.气相色谱-质谱法测定奶粉中三聚氰胺及其同系物[J].食品与发酵工业，2009,35(7):143-145.

[5]蒋伯成，张剑平，于秋影.液相色谱质谱联用法快速测定配方奶粉中的三聚氰胺[J].高师理科学刊，2009,29(3):51-53.

[6]卢日刚，梁佳.固相萃取-毛细管电泳法测定奶粉中三聚氰胺的含量[J].现代食品科技，2010,26(4):423-425,420.

[7]赵宁，徐飞，吴小平，等.ELISA一步法快速检测牛奶中三聚氰胺的研究[J].中国畜牧兽医，2011,38(4):124-126.

[8]金根娣，杜诗，胡效亚.电化学方法快速测定牛奶中的三聚氰胺[J].食品科学，2011，32(18):291-295.

[9]LIAO Chenwei,CHEN Yueru,CHANG Jenlin,et al.A sensitive electrochemical approach for melamine detection using a disposable screen printed carbon electrode[J].Electroanalysis,2011,23(3):573-576.

TS252.1

A

1006-4907（2017）01-0044-03

10.3969/j.issn.1006-4907.2017.01.020

2017-01-12

林品言（1985～），女，硕士，工程师，研究方向为畜禽水产品检测。