不同规模猪场腹泻仔猪大肠杆菌的分离鉴定及药物敏感性检测

2017-04-05杨宇

湖南畜牧兽医 2017年1期

关键词：革兰氏肛门耐药性

杨宇

（湖南省长沙市望城区动物疫病预防控制中心，湖南长沙410200）

不同规模猪场腹泻仔猪大肠杆菌的分离鉴定及药物敏感性检测

杨宇

（湖南省长沙市望城区动物疫病预防控制中心，湖南长沙410200）

从湖南不同地区9个猪场采集腹泻仔猪的肛门拭子，利用麦康凯平板、革兰氏染色镜检和PCR方法共鉴定499株大肠杆菌。并通过K-B法检测各猪场分离的大肠杆菌对5类抗生素（四环素类、磺胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类、头孢类）中的9种药物的耐药性。结果显示：各猪场分离的大肠杆菌群体上对头孢噻吩、头孢曲松、恩诺沙星、阿米卡星的耐药性较低，对氧氟沙星、氟苯尼考、强力霉素、复方新诺明、链霉素的耐药性较高。

大肠杆菌；分离鉴定；药敏试验

仔猪大肠杆菌病（Colibacillosis in piglets）是危害仔猪健康较严重的细菌传染病之一，给养猪业带来较严重的经济损失[1]。为掌握湖南省致仔猪腹泻大肠杆菌的耐药性流行情况，本试验选取湖南省部分地区的9个规模猪场，采集腹泻仔猪的直肠肛门试子，共分离鉴定出499株腹泻仔猪源大肠杆菌。经药物敏感性试验，分析各猪场大肠杆菌的药物敏感性，为临床上用药提供科学的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

麦康凯培养基、抗菌药物药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司；革兰氏染色试剂盒，购自北京索莱宝科技有限公司；即用型PCR试剂盒3.0，购自TIANZ公司。

1.2 方法

1.2.1 采样猪群的选择

从湖南省不同地区选取9个规模猪场，采集临床上有腹泻表现仔猪的肛门拭子适量。

1.2.2 细菌的分离与鉴定

在无菌条件下，将采集的直肠肛门拭子样品划线接种于麦康凯平板，37℃下培养18～20 h。从每份样品的麦康凯平板上挑取3～4个大肠杆菌疑似菌落，在血琼脂平板上划线纯化。

涂片革兰氏染色镜检：无菌挑取经纯化疑似大肠杆菌的菌落与洁净玻片上的无菌水混合，涂布均匀，经自然干燥后火焰固定。按革兰氏染色试剂盒说明书染色镜检。

PCR鉴定：根据文献[2]设计检测大肠杆菌的特异性引物，目的片段大小为264bp，并由上海铂尚生物有限公司合成。FP：5’-ATGAAAGCTGGCTACAGGAAGGC-3’；RP：5’-GGTTTATGCAGCAA CGAGACGTC-3’，按常规方法对大肠杆菌进行PCR鉴定。

1.2.3 药物敏感性检测

根据各抗生素的抗菌谱选择头孢噻肟、头孢曲松、恩诺沙星、氧氟沙星、氟苯尼考、强力霉素、复方新诺明、阿米卡星和链霉素9种药敏纸片，按K-B法进行药物敏感性检测。

2 结果

2.1 采样猪群的临床资料

选择湖南省的汨罗市等地9个规模猪场，采集疑似有大肠杆菌病腹泻仔猪的直肠肛门拭子，并根据各猪场仔猪腹泻的发病情况，采集有腹泻症状的仔猪直肠肛门拭子，保存于装有灭菌PBS的1.5 mL的离心管中，将样品带回实验室。

2.2 细菌分离鉴定结果

采集的腹泻仔猪肛门拭子，接种于麦康凯平板划线培养，见每份样品中都有若干的红色单菌落。将已纯化的菌落进行涂片和革兰氏染色镜检，观察到分离菌为革兰氏阴性的小杆菌，且形态很单纯，代表性镜检涂片见图1。

使用大肠杆菌特异性引物PCR扩增鉴定分离的大肠杆菌可疑菌株，并进行0.9%的琼脂糖电泳胶，采集信号，可疑菌株均能扩增到约264bp的特异性条带，部分检测结果见图2。

2.3 药物敏感性结果

为了解决临床生产中的问题，以各猪场为组将其所分离的大肠杆菌混合一起所做的药敏试验。由表1可见每个猪场分离出的大肠杆菌对头孢噻吩、头孢曲松、恩诺沙星和阿米卡星的耐药性较低，对氧氟沙星、氟苯尼考、强力霉素、复方新诺明和链霉素的耐药性较高。

图1 细菌革兰氏染色镜检拍照（100×）

图2 部分大肠杆菌可疑株PCR鉴定图

表1 各猪场大肠杆菌药敏性检测结果

3 讨论与分析

本次调查的9个不同规模猪场分别分布在汨罗市、湘阴县、浏阳市、湘潭县、衡阳市和郴州市，具有一定的地域代表性。同时发现被调查猪场都有一定程度的仔猪腹泻情况，根据仔猪日龄大小及其临床症状，分别采集1～7d龄、10～21d龄和断奶三个阶段，临床表现有剧烈腹泻、排黄色水样稀便或白色粥样稀便等的仔猪直肠肛门拭子，采样数量能够大体的反应整个猪场仔猪腹泻的情况。对调查采集的腹泻仔猪直肠肛门拭子在麦康凯平板培养基中划线分离，后经纯化，涂片染色镜检及PCR鉴定共分离出499株大肠杆菌。

本研究考虑到菌株数量多，且只是为了掌握不同猪场大肠杆菌的整体耐药情况，所以将每个猪场所分离到的大肠杆菌作为一组进行药物敏感性检测，指导于临床用药。对每个猪场所分离的大肠杆菌进行药物敏感性检测，发现其耐药性略有不同，但其中对头孢噻吩、头孢曲松、恩诺沙星、阿米卡星的耐药性较低，同汤起武[3]在2014年关于大肠杆菌的耐药性的报道一致。对氟苯尼考和复方新诺明的耐药性较高可能与猪场习惯常用这两种药物有关。