谢美娟 杨学习 李明

•综 述•

下一代测序技术在胚胎植入前遗传学检测中的应用

谢美娟 杨学习 李明★

以下一代测序技术（next⁃generation sequencing，NGS）为代表的基因组学技术的迅猛发展给全面深度的染色体筛查和基因诊断提供了机会。NGS也迅速应用于胚胎植入前遗传学诊断（preimplantation genetic diagnosis，PGD）和胚胎植入前遗传学筛查（preimplantation genetic screening，PGS）临床检测中，成为常规检测技术，经济与可靠使其具有更广阔的应用前景。单细胞全基因组扩增（whole genome amplification，WGA）技术的进步使得NGS在PGD和PGS的临床应用中能够更加全面了解植入前胚胎的遗传学信息，可以检测到更加细微的差异；基于NGS技术的PGS和PGD将给移植成功率和试管婴儿（in⁃vitrofertilization，IVF）出生率带来明显提升。本文主要介绍PGD/PGS的定义、传统的PGD/PGS检测技术，单细胞全基因组扩增技术以及NGS在PGD/PGS中的应用。

胚胎植入前诊断；胚胎植入前筛查；下一代测序

2015年12月 9日《Reproductive Biology and Endocrinology》杂志报道了辅助生殖技术（assisted reproduction techniques，ART）生育治疗的国际调查结果，与前2年相比，不孕患者的数量逐年上升［1］；尽管体外受精⁃胚胎移植（in vitrofertilization and embryo transfer，IVF⁃ET）可以用于不孕的治疗，但这个过程还是低效的，成功率仍然较低。胚胎植入前遗传学检测主要包括胚胎植入前遗传学诊 断（preimplantation genetic diagnosis，PGD）和胚胎植入前遗传学筛查（preimplantation genet⁃ic screening，PGS），是指在人工辅助生殖过程中，对胚胎进行种植前活检和遗传学分析，以选择无遗传学疾病的胚胎植入子宫，从而获得正常胎儿的诊断/筛查方法。这2种技术建立在IVF基础之上，可直接筛除有问题的、不健康的胚胎，挑选正常的胚胎植入子宫，可阻断致病基因的纵向传递，降低反复流产率，提高患者的临床妊娠率，避免因引产给孕母带来的身心创伤。PGD和PGS作为ART 的工具应用也在逐渐增多［2⁃6］。本文主要介绍PGD/PGS的定义、传统的PGD/PGS检测技术、单细胞全基因组扩增技术（whole genome amplifica⁃tion,WGA）技术以及下一代测序基因组扩增技术（next⁃generation sequencing，NGS）在 PGD/PGS 中的应用。

作者单位：南方医科大学检验与生物技术学院，广东，广州510515

1 PGD/PGS概况

早在60年代，Edwards就提出了胚胎植入前遗传学诊断的设想［7］，直到 1990 年 Handyside等［8］对1例性连锁遗传病夫妇成功地进行了PGD，并获得妊娠，标志着PGD应用于辅助生殖临床的开始。PGD是通过对早期胚胎部分细胞进行遗传学分析和筛查，将无遗传病的胚胎移植入宫腔，从而获得健康的胎儿。我国第一例PGD在2000年由中山大学附属第一医院庄广伦实验室完成，随后姚元庆团队也在这方面陆续有报道［9］；PGD发展至今，其诊断的疾病种类也在逐渐增加，从最初对单基因遗传病的诊断到染色体异常、人类肿瘤易感基因的分析、线粒体病、人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）配型胚胎的检测等［2］。

PGS又称“PGD⁃非整倍体筛查”，是指运用PGD相同的技术手段检测早期胚胎染色体数目和结构，从而挑选正常的胚胎植入子宫，以期获得正常的妊娠，提高患者的临床妊娠率，降低多胎妊娠。研究发现，随着女性年龄的增长，胚胎染色体异常的发生率逐年增高［10］，胚胎中的染色体异常是造成IVF反复失败和早期流产的重要原因［11⁃12］。因此，PGS 主要针对的人群为女方高龄、不明原因反复流产、IVF反复失败以及男性导致的不孕不育等。自Munné等［13］在1993年第一次报道了对胚胎进行PGS以后，经PGS诞生的婴儿也越来越多［14⁃15］。

2 传统的PGD/PGS检测技术

首例成功诞生的经PGD合并表型正常的婴儿采用的是PCR技术，该技术主要用于性别和单基因病的诊断，然而该技术存在着5%～20%的等位基因脱扣发生率［16］。荧光原位杂交（fluorescentin si⁃tuhybridization，FISH）作为最初PGD/PGS标准技术用于染色体检测，可以筛选出染色体正常的胚胎，使得更多的不孕夫妇孕育了自己的健康后代［17］。此方法简单快速，但由于探针的交叉影响并不能一次全面地检测所有染色体。而且容易受到细胞固定和信号重叠等因素的影响，导致分辨率和准确率降低。随后，为了填补分子遗传学与细胞遗传学间的空白，比较基因组杂交（compara⁃tive genomic hybridization，CGH）技术出现，其优点是可以分析全部染色体，临床上很多生殖中心采用该方法对高风险产生非整倍体胚胎的夫妇进行胚胎染色体非整倍性改变的全面检测［18］以及PGD［19］。但它分析时间长，不能检测出多倍体，也不能检出平衡的、复杂的染色体畸变。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）芯片技术可检测全部染色体非整倍体和部分单基因遗传病，并为每枚胚胎提供独特的DNA图谱；但其耗时过长，且成本高、数据分析困难。总体来说，CGH和SNP芯片技术的临床应用在一定程度上改善了不孕夫妇的临床结局［20⁃21］，但这些技术又有各自的局限。随着众多报道［22⁃23］NGS 应用于无创产前筛查得到了高检出率与准确度，学者们开始考虑将NGS应用于PGD/PGS，以选出优质胚胎进行植入。

3 单细胞全基因组扩增技术

NGS是单细胞水平上对基因组进行测序的利器，WGA是下一代测序在PGD和PGS临床应用的关键一步，其高度均一性和保真度是精确测定拷贝数变异（copy number variation，CNV）和单核苷酸变异（single nucleotide variants，SNV）等基因组变异的必要条件。WGA与测序技术结合能够全面了解胚胎植入前的遗传学信息，但扩增产量及SNV识别假阳性及假阴性的能力限制了当前流行的WGA方法。WGA技术发展至今主要分为2种类型：基于热循环以PCR为基础的WGA技术，如简并寡核苷酸引物PCR（degenerate oligonucle⁃otide primer PCR，DOP⁃PCR）、连接反应介导的PCR（ligation mediated PCR，LM⁃PCR）、扩增前引物延伸反应（primer extension pre⁃amplification，PEP）以及多次退火环状循环扩增技术（multiple an⁃nealing and looping⁃based amplification，MALBAC）技术等；基于等温反应不以PCR为基础的WGA技术，如多重置换扩增（multiple displacement amplifi⁃cation，MDA）。这里主要介绍临床上较为常用的2种单细胞WGA技术，MDA和MALBAC。

3.1 MDA

MDA的原理是六聚体引物与变性DNA随机结合，在等温以及Phi 29聚合酶作用下，发生链置换合成反应，每个置换后的单链作为模板，与引物结合，可扩增获得高产量DNA。MDA作为一种可获得高产量以及高保真产物的WGA方法，减少扩增偏倚，而且产物片段大小高于其他PCR方法，该方法在2002年首次被报道［24］。MDA具有产量高、扩增片段长（平均片段长度可达10 kb）、均一性好、保真性高、覆盖率高等优点；但是也有报道其存在一定的缺陷：受细胞模板起始量影响大，当扩增模板起始量极少时，其扩增产物的覆盖率、准确度下降［25］；还存在一定的等位基因脱扣（allele drop⁃out，ADO）率且其ADO率也与起始模板量有关［26］。MDA方法部分程度上解决了扩增偏向的问题，实现了比PCR更均一的扩增，该酶的高保真性也阻止了错误的进一步扩大。

3.2 MALBAC

2012年，哈佛大学谢晓亮在《Science》上发表了单细胞全基因组扩增新技术MALBAC，即多次退火环状循环扩增技术［27］。MALBAC利用特殊的引物，使得扩增子结尾互补成环，防止了DNA的指数性扩增，解决了扩增偏倚，同时保持了90%以上的基因组扩增覆盖度，使得检测单细胞中较小的DNA序列变异变得更容易，分辨率提高，可以检测单基因突变，以及同时检测多个基因。2014年9月世界上首例经MALBAC基因组扩增高通量测序进行单基因遗传病筛查的试管婴儿在北京大学第三医院诞生。MALBAC技术具有单细胞的基因测序覆盖率高（能够达到93%）、ADO率低、扩增偏倚低以及单细胞扩增起始模板量低等优点；但其也存在一定的缺点，比如DNA酶保真性较低，因此DNA复制时错误率较高，这样会导致假阳性结果的出现。此外，谢晓亮等［28］在2015年9月又发表其单细胞测序技术新成果，他们开发出了一种基于乳液的扩增方法来抑制扩增偏移检测单细胞拷贝数变异（CNV），同时以高精确度检测单核苷酸变异（SNV）。单细胞测序技术解决了用组织样本测序时或样本少无法解决的细胞异质性难题。

对于MDA和MALBAC技术的优劣，业界还没有统一的定论，在低深度测序中（25×），两者的覆盖度均可，均一度各执说法。关于2种方法优劣的比较分析已有文献报道［29⁃30］，可基于特定的实验目的选择不同的扩增方法，对于CNV的检测可以选用MALBAC，而MDA则由于其高保真性可用于SNV的检测。

4 NGS在PGD/PGS中的应用

Audibert等［1］的调查结果也显示参与调查的生育学家们期望更多的使用PGD、PGS和其他提高着床率的技术。随着胚胎发展实时检测技术及PGD/PGS技术的出现，胚胎选择成为不孕治疗最有发展前景的领域。目前，NGS技术具有数据准确度更高、实验重复性更好等优势，且随着其价格不断下降，其在PGD/PGS方面已经有了一定的应用，也是被认可的技术，只是方法学上仍在不断改进。单细胞全基因组扩增技术的不断进步，使得单基因遗传病和染色体病可以同时进行诊断，这对一个胚胎的筛选有了相对更为精准的结果，进而提高筛选后再植入的成功率。近几年，利用低通量全基因组测序以及针对致病基因进行目标区域靶向捕获的NGS应用于PGD/PGS的成功案例报道逐渐增多。Treff等运用下一代测序技术对多种单基因病如囊性纤维化（cystic fibrosis，CF）、沃克华宝综合症（Walker⁃Warburg syndrome，WWS）、家族性自律神经失调（familial dysautonomia，FD）、抗维生素D性佝偻病（vitamin D⁃resistant rickets，VDRR）、神经纤维瘤（neurofibromatosis1，NF1）等进行PGD，检测结果与传统方法相比可靠性达到100%［31］；国内也有许多的成功案例被报道：姚元庆团队采用下一代测序技术分析单细胞水平的染色体拷贝变化，选择正常胚胎植入，于2014年9月顺利分娩健康女婴［32］。谢晓亮、乔杰、汤富酬团队在国际上首次建立了一种采用下一代测序同时进行突变位点、染色体异常、以及连锁分析检测的方法，并利用该技术成功帮助2个病例（一例是常染色体显性遗传疾病，另一例是发生在X染色体上的隐性遗传疾病），进行胚胎筛选后，这2对夫妇均已得到健康的后代［33］。2013年，我国湘雅医院团队报道了采用NGS检测囊胚的PGS成功病例［34］；2014年Fiorentino等［35］则对190例卵裂球WGA产物进行染色体非整倍体CGH与NGS检测方法的比较，结果表明NGS有高度的一致性，相比之下在成本和精确性上，NGS更有优势。到目前为止，NGS应用于胚胎植入前非整倍体改变筛查中的价值已得到证实。这些成功案例均表明NGS技术应用于PGD/PGS已经比较成熟。但同时NGS在PGD/PGS中的应用还受到一定限制，例如暂时还不具备检测嵌合型的胚胎、单亲二倍体以及检测分辨率有限等，有待于测序技术的进一步完善，或者联合其他技术手段达到最佳的诊断。另一方面，NGS在PGD/PGS中的应用依赖于WGA技术的进步，而WGA还存在一定程度的ADO、扩增偏倚等问题，因此，需要更多的探索来改进现有的技术，更多的研究来进一步明确其诊断价值。

5 展望

一直以来，PGD/PGS活检的遗传物质从卵子的第一极体、第二极体、卵裂期胚胎的卵裂球到囊胚滋养外胚层细胞，都存在着争议；极体活检被认为仅能反映母方的遗传信息且容易发生退化影响诊断效率；卵裂期以及囊胚期胚胎则存在着高嵌合率等，此外，PGD/PGS是通过侵入性操作获得诊断结果，其对子代的影响还需要长期大样本的随访。因此，研发一种安全又有效的筛查技术十分必要。以谢晓亮带领的研发团队宣布了全球首例接受无创胚胎染色体筛查（non⁃invasive chromosome screening，NICS）的试管婴儿于无锡市妇幼保健院生殖中心健康诞生。无创PGS/PGD技术的出现，将彻底解决因为胚胎活检存在的安全争议，也意味着在不久的将来，可以更好的服务于临床。2015年卫计委妇幼保健服务司发布了《关于辅助生殖机构开展高通量基因测序植入前胚胎遗传学诊断临床应用试点工作的通知》，审批通过了13家医疗机构开展高通量基因测序植入前胚胎遗传学诊断（PGD）临床试点，也意味着NGS将更加的普遍广泛地用于临床PGD/PGS。

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Application of the next generation sequencing technology in preimplantation genetic detection

XIE Meijuan，YANG Xuexi，LI Ming★
（School of Laboratory Medicine and Biotechnology，Southern Medical University，Guangzhou，Guangdong，China，510515）

With the rapid development of genomics technology,next⁃generation sequencing(NGS)offered an opportunity for comprehensive chromosome screening and gene diagnosis.NGS can also be applied to preimplantation genetic diagnosis(PGD)and preimplantation genetic screening(PGS)and becomes a routine clinical detection technology.In addition,the economy and reliability of NGS makes it have a wider application prospects.The progress of whole genome amplification(WGA)of single cell leads to the clinical use of NGS in PGD and PGS more comprehensive to learn the genetic information of preimplantation embryos.The comprehensive chromosome screening and gene diagnosis for embryonic genome will improve the success rate of embryo transplantation and raise the birth rate,which makes NGS more and more irresistible in PGD and PGS.In this review,the PGD/PGS definition,technology of whole genome amplification and the application of NGS in PGD/PGS will be discussed.

Preimplantation genetic diagnosis;Preimplantation genetic screening;Next⁃generation sequencing

国家自然科学基金（81302327）；广州市重大科技攻关项目子课题（2014Y2⁃00220）

★通讯作者：李明，E⁃mail:mingli2006_2006@126.com