王雪银，宋献美，马云云

(河南医学高等专科学校，郑州451191)

siRNA抑制Caspase-3表达对内毒素诱导肝细胞凋亡的影响

王雪银，宋献美，马云云

(河南医学高等专科学校，郑州451191)

目的观察利用小干扰RNA(siRNA)抑制Caspase-3表达对内毒素诱导肝细胞凋亡的影响。方法针对Caspase-3的DNA序列843～1 634 bp设计引物，常规分子克隆至慢病毒表达载体pLenti-7.1，同时设置空载体为阴性对照；利用Lipofectamine 2000转染至293T细胞，48 h后收获抑制Caspase-3表达病毒质粒V-Caspase-3和空载体病毒质粒V-control。将肝细胞HL7702随机分为观察组和对照组，分别加入V-Caspase-3、V-control培养4 h，均与终浓度为20 mg/L的内毒素共培养12 h。采用Western blotting 法检测Caspase-3蛋白，流式细胞术测算细胞凋亡率，原位末端标记技术测算细胞凋亡指数(AI)，MTT法观察细胞增殖活力。结果观察组HL7702细胞Caspase-3相对表量为17.32±2.16，低于对照组的62.14±4.36(P<0.01)；观察组HL7702细胞凋亡率为28.75%，低于对照组的72.67%(P<0.01)；观察组HL7702细胞AI为23.52±1.24，低于对照组的54.26±1.87(P<0.01)；观察组HL7702细胞增殖率为65.47%±6.24%，高于对照组的41.39%±4.87%(P<0.01)。结论通过siRNA抑制Caspase-3表达能有效降低内毒素诱导的HL7702细胞凋亡，从而增强细胞增殖活性。

小干扰RNA；半胱氨酸蛋白酶3；内毒素；肝细胞；细胞凋亡；细胞增殖

肝衰竭是内毒素血症的一个严重并发症，其发生率高达85%[1]，目前临床缺乏有效治疗措施。内毒素是革兰阴性菌细胞壁外膜的成分，其主要组成部分是脂多糖(LPS)。细菌内毒素可诱导多种细胞凋亡,尤其是肝细胞代谢旺盛时最易损伤[2]。研究证实，Caspase-3 是凋亡过程中最重要的蛋白酶, 是多条凋亡途径的共同下游效应部分，同样也参与了内毒素导致的肝细胞凋亡过程[3,4]。小干扰RNA(siRNA)是对转录后调控最重要的手段，因在体内的转录效率和稳定性不佳而限制了进一步的开发利用[5]。慢病毒由于高效的感染效率和体内外安全性，已成为新的RNA干扰研究工具。2016年5～12月，我们利用慢病毒介导的siRNA抑制内源性的Caspase-3，观察对内毒素所致肝细胞凋亡的影响，为临床治疗提供新的策略。……