孙法超 张元超 王玉超 肖一红

（山东农业大学动物科技学院 山东 泰安 271018）

猪流感病毒HA基因研究进展

孙法超 张元超 王玉超 肖一红

（山东农业大学动物科技学院 山东 泰安 271018）

猪流感是由猪流感病毒引起的一种急性、热性、高度接触性呼吸系统疾病。极易继发感染其他病，像一些细菌，病毒和寄生虫病等。使得病情更加复杂，从而提高了病猪的死亡率，给养殖业造成了巨大的经济损失。血凝素(HA)基因是流感病毒表面的主要抗原基因，变异频率很高，是病毒发生抗原变异的主要原因。HA与流感病毒感染的宿主范围和致病力密切相关，同时还能诱导机体产生中和抗体，是流感病毒最重要的一个蛋白。因此，本文对猪流感病毒的HA基因进行了综述，为进一步对猪场的流感防治以及疫苗研发提供理论依据。

2016YFD0500201 国家重点研发计划

猪流感病毒(Swine influenza virus，SIV)属于正粘病毒科，A型流感病毒属，是一种单股负链RNA病毒。猪流感(Swine influenza，SI)是由A型流感病毒引起的一种急性、热性、传染性呼吸系统疾病。该病的发生无明显的季节性，但在春秋和冬季，尤其季节交替时易发，易感猪群不分年龄、性别和品种，临床症状主要表现为食欲下降，精神沉郁、体温升高、呼吸困难、咳嗽以及流涕等。20世纪30年代Shope从猪的体内第一次分离到了一株H1N1亚型猪流感病毒，因此由该病毒引起的猪的疾病称为SI[1-3]，之后全球范围内均出现过相关的报道。另外，由于人的流感病毒和禽的流感病毒的受体同时存在于猪体内，因此认为猪是人、禽和猪流感病毒通过基因重排并产生新的病毒的“混合器”(Ito et al. 1998；Karasin et al.2006；Thacker et al.2008；Naffakh et al.2009)。当前已经发现的SIV有很多种，包括H1N1、H1N2、H2N3(Ma et al.2007)、H3N1(Lekcharoensuk et al.2006)、H3N2、H3N3(Karasin et al.2004)H3N6、H4N6、H5N1(Lvov et al.2006)和H7N9(Hai et al.2008)等多种不同的亚型。在全球范围内当前的流行毒株以H1N1、H1N2和H3N2为主。SIV的基因组由8个大小不等的独立片段构成，3种多聚酶蛋白(PB2、PB1和PA)、核蛋白(NP)、基质蛋白(M1和M2)、血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、核输出蛋白(NEP)和非结构蛋白(NS1和NS2)共11个蛋白。HA是一种主要的糖蛋白，该蛋白有以下几个主要功能：能够刺激机体，诱导机体产生中和性抗体；可以识别并结合宿主细胞表面的特异性受体；参与流感病毒囊膜与核内膜的融合。所以，对于HA基因的研究还是具有重要意义的。

1 HA基因的特点

流感病毒的基因由八个单链RNA组成，通过对绝大多数流感病毒的全基因序列进行测序，以及序列的比对，发现所有片段中，5′端的前13个核苷酸相同，均为GGAACAAAGAUGAppp5′；3′前12个核苷酸也相同，为3′HO-UGGU/CUUUCGUCC;每个序列都有Polyu保守区，位于每个序列的5′端第15至21核苷酸处，其主要功能是利用病毒mRNA的合成时生成的PolyA信号来终止病毒mRNA的合成。流感病毒RNA片段4编码HA，HA编码566个氨基酸，大小为75kD。HA基因的亚型较多，很容易发生变异，A型流感病毒亚型的划分可以依据HA基因及其蛋白的抗原特性。(Lind-strom et al.1998)。

2 HA蛋白的特点以及功能

（1）作为流感病毒中的重要蛋白，HA蛋白分子有信号肽、胞浆域、跨膜域以及胞外域这几个结构域。HA的糖基化位点一般有6～10个[4]。HA要发挥作用，需要经过裂解酶的裂解，糖基化和脂肪酸的乙酰化这几个加工处理过程。此外，HA水解后可分成两部分：HA1和HA2，前者氨基酸残基有319～328个，后者为221～222个。两者之间以1个精氨酸相连。HA1可以与宿主细胞的受体进行结合；其功能主要是使病毒与宿主细胞表面的唾液酸受体结合，之后等病毒吸附后，宿主细胞会通过内吞作用使病毒粒子进入。HA2主要参与细胞的融合。HA水解是流感病毒感染的先决条件[5-8]。此外，病毒的致病性也与HA糖基化位点和裂解位点处碱性氨基酸的变化有关。（2）对于HA的蛋白表达，张祥斌等（2008）用pBCX高效可溶表达载体成功表达了H1N1亚型的蛋白，随后又通过Westernblot实验证实了可溶表达的融合蛋白对H1N1亚型猪流感病毒阳性血清具有良好的免疫原性，并且最后筛选到的两株针对HA蛋白抗原表位的单克隆抗体就是用此蛋白作为抗原的。

3 HA基因工程疫苗

基因工程疫苗中研究较多的是HA蛋白基因，主要是HA蛋白相比其他蛋白有着较好的免疫原性，以下几种疫苗在猪流感中较为常用：

3.1 重组活载体疫苗 猪流感病毒重组活载体疫苗是将HA或者NA基因插入到已知的病毒活载体中致使基因获得高效表达。这种疫苗有着较多的优点，一方面是接种后不受母源抗体的影响，其他疫苗的部分缺点得到改进，另一方面是只需接种少量疫苗就可以产生较多的外源蛋白(Kitikoon et al. 2006)。对于猪流感H3N2疫苗的的获得，国内学者周国辉等(2005)曾把伪狂犬疫苗毒株Bartha-K61的基因组与含有H3N2猪流感HA基因的转移载体pLTK-HA共转染Vero细胞，并成功得到了重组伪狂犬病病毒，随后对其免疫保护效果进行测试，结果较为理想。所以，重组活载体HA疫苗具有较好的免疫活性。

3.2 亚单位疫苗 目前亚单位疫苗的制作主要是提取的一些病原体的免疫原蛋白，之后再对有免疫活性的片段筛选。亚单位疫苗由于其主要表面蛋白质种类少，致使一些无关抗原诱发抗体的产生得到了避免，所以疫苗本身的副作用也相应地减少了。在基因工程中可以通过DNA重组技术把HA基因连接到载体质粒，之后再导入表达系统中进行扩增表达，此种方法的生产成本较低，而且还可以得到较多的HA蛋白。该种亚单位疫苗可以免疫保护多种H亚型毒株(Ste-phenson et al.2004）)。尽管亚单位疫苗在应用上有着一些不错的特点，但是在生产过程中也存在很多问题，所以对于亚单位疫苗的生产研究条件还需进一步的优化。

3.3 DNA疫苗 猪流感DNA疫苗的制作主要是将该病毒主要免疫原基因HA或NA插入到真核表达质粒中，然后将该重组质粒导入机体细胞，最后诱导机体产生特异性免疫应答。(Larsen etal .2001)曾对猪用表达的HA的DNA疫苗进行免疫，然后在初免过后四周，又用灭火苗进行加强免疫了一次，与此同时，和只进行DNA疫苗接种的两次进行比较，发现前者产生的抗体水平更高。(Ljungberg et al.2002)也曾构建了嵌合HA质粒，他用的两株A型流感毒株在遗传学和血清学上是不相同的，构建完成后疫苗接种了24只成年雪貂，最后对雪貂体内的抗体经和HI和ELISA进行检测，构建的嵌合质粒对小鼠有较高的抗体滴度。因此与传统疫苗相比可以看出，该种疫苗总的来说可以产生一定的免疫保护力，但重复性与免疫效果还是不太理想，所以对该种疫苗的研究还有待提高。

4 结语

猪流感病毒在我国猪群中广泛存在，给我国养殖业带来了巨大的经济损失。为防治猪流感，减轻损失，对该病的疫苗研究是必要的。HA基因是猪流感病毒中重要的基因，对该基因以及蛋白的研究可以为新型猪流感病毒疫苗的开发提供理论基础，所以笔者对于该病防治还是充满了信心。

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