董金杰 王 凡 陈苗苗 牟克斌 王超英 刘 萍*

（①中农威特生物科技股份有限公司 兰州 730046 ①中国农业科学院兰州兽医研究所 兰州）

口蹄疫灭活疫苗146S含量检测方法概述

董金杰①①王 凡①陈苗苗①牟克斌①①王超英①①刘 萍①*

（①中农威特生物科技股份有限公司 兰州 730046 ①中国农业科学院兰州兽医研究所 兰州）

口蹄疫(Food and Mouth Disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Food and Mouth Disease Virus，FMDV)引起的偶蹄类动物的急性、热性、接触性、烈性传染病。世界范围内预防口蹄疫发生的有效方法是疫苗免疫，疫苗生产过程中，各环节过程控制至关重要，其中准确定量完整的口蹄疫病毒粒子(146S)尤为关键，因为146S抗原的含量直接决定了口蹄疫灭活疫苗的质量，所以准确，快速，敏感的定量方法势在必行，本文对146S含量检测主要方法的研究进展做一综述。

1 密度梯度离心法

主要有蔗糖密度梯度离心法和氯化铯密度梯度离心法两种，其中蔗糖密度梯度离心法应用较为广泛。

1.1 蔗糖密度梯度离心法 （1）该方法最早由Barteling等于1974年建，是采用10%～25%的蔗糖梯度，45000r/min离心30min，测定各部分在254nm处的吸光值，根据峰面积计算146S含量。但病毒液中146S含量太少时，不能直接检测，需要用PEG-6000对样品进行浓缩。最近几年，很多研究人员对此方法进行了改进。董金杰等(2010)将灭活的FMDV经超滤浓缩后分别加于15%～45%和15%～55%的蔗糖梯度顶部，35000/min，超速离心2.5h后，用紫外分光检测仪检测各区带在259nm处的吸光值，绘制吸收峰图谱，并计算峰的面积从而得到146S抗原的含量。试验结果表明，15%～45%的蔗糖梯度能较好的纯化FMDV抗原，分离效果比15%～55%蔗糖梯度更为理想。因此15%～45%的蔗糖梯度更适合用于146S的定量检测。卢永干等（2010）采用氯仿或三氯乙烯初步纯化病毒液，超速离心对病毒液进行浓缩，15%～45%的蔗糖梯度离心进行病毒146S的定量。（2）两种方法存在的缺点是：所需样品量大，至少需10ml才能检测；过程繁琐，样品必须经过浓缩步骤(超滤、沉淀和悬浮等过程)，抗原损失不确定，检测结果不能反映真实值，导致重复性和稳定性差。往往在实验室之间，人与人之间检测结果变化率大。因此，董金杰等(2012)在原有的研究基础上做了进一步改进，改进后无须将FMDV浓缩，可直接加FMDV于15%～45%的蔗糖梯度顶部，35000/min，超速离心3h后，用连续紫外检测仪检测各区带在259nm处的吸光值，绘制吸收峰图谱，通过计算吸收峰面积得出146S的含量。此方法的改进大大克服了样品浓缩导致的周期长，样品量大等缺点，同时结果的稳定性和重复性得到了保证，目前已在中农威特生物科技股份有限公司应用约两年，检测各类样品8000余份次。实践应用结果显示，当样品146S含量在1～15µg/ml时，相对偏差基本在5%以内，为中农威特生物科技股份有限公司指导疫苗生产、质量控制和浓缩纯化工艺的开发和研究提供了技术支撑和保障。但此方法的局限是不能检测多价成品疫苗中各血清型抗原的146S含量。

1.2 氯化铯密度梯度离心法 比蔗糖密度梯度离心法更为精确的测定146S含量的方法是通过氯化铯密度梯度离心定量分析，在每毫升微克量水平估测出146S抗原量，并用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测病毒抗原多肽的完整性以确定其质量。但因氯化铯价格较为昂贵，未被广大科研工作者和疫苗生产厂家广泛应用。

2 ELISA方法

（1）Crowther等(1979)是最早使用ELISA方法检测和定量146S的，使用直接ELISA、间接ELISA、夹心ELISA方法同时定量FMDV，获得很好的效果，三种方法的结果相同，灵敏度高，可检测样品含量在5～30ng/ml时的146S。在此基础上，Abu Elzein等(1979)建立了一种夹心ELISA方法，使用的是豚鼠抗纯化且灭活FMDV 146S的血清包被酶标板，加入待检抗原，最后加入同源的酶标记的IgG，加入显色底物，NaOH终止反应，酶标仪检测OD405nm。在研究中发现，豚鼠抗纯化且灭活FMDV146S的血清在免疫扩散试验、补体结合试验、双抗体放射免疫试验中与12S和146S都能发生反应，然而在此双夹心ELISA试验中该血清不与12S抗原发生反应，因此认为这种方法可以在有12S存在情况下特异性定量146S。（2）李乐等(2008)建立的ELISA的方法则是利用市场上现有的口蹄疫抗原捕获ELISA试剂盒进行检测，进行了146S抗原含量和ELISA结果的相关性研究，结果表明，抗原含量和OD450nm表示的ELISA结果有对数线性关系，相关系数为0.98。此方法与蔗糖密度超速离心方法定量比较，6个样品检测后，两种方法检测出的抗原含量差异在0.2～2.5μg/ml之间，且ELISA结果均高于蔗糖密度超速离心方法，由此可见两种方法之间的检测差异较大。Ouldridge等(1984)介绍了一种间接夹心ELISA专门用于定量收获病毒液中的146S。多价兔血清用于包被微量滴定板，多价豚鼠血清用于试验的第二相。建立的夹心ELISA方法不检测12S抗原，因此适于定量146S抗原。但是，Van Mannen等(1990)发现这种ELISA方法既检测12S也检测146S，因此不适于定量146S，这与Ouldridge等的结果相反。（3）鉴于以上方法的局限性，因此进而发展出了有单克隆抗体参与的ELISA方法，Crowther等(1995)建立了一种双抗体夹心ELISA方法，此方法使用的单克隆抗体为普通的抗FMDV单克隆抗体。该方法涉及使用了针对O型病毒VP1环状区域的线性抗原表位的病毒中和性单抗隆抗体。在夹心ELISA中，这一单抗既被用作捕获试剂也被用作检测试剂。Crowther等建立的方法也是不检测蛋白酶裂解过的146S。Yang等(2008)分离出了两株抗FMDV的单克隆抗体，经试验后发现这两株单克隆抗体可用于定量疫苗生产过程中FMDV的146S含量。此方法在Pirbright疫苗研究中心测定疫苗生产过程中的146S含量受到广泛的应用。虽然单克隆抗体ELISA方法具有较多的优点，但是制备单克隆抗体的过程较为复杂，而且ELISA方法检测受到FMDV血清型和毒株的限制。一种单克隆抗体ELISA方法所能检测的FMDV毒株的种类是有限的。

3 凝胶过滤色谱法

董金杰等(2007)利用Superose 6 HR柱(GE公司)对口蹄完整病毒进行分离纯化，即将各种方法处理的BHK-21细胞口蹄疫病毒抗原制备物和阴性对照经氯仿去除大部分脂蛋白，再经Superose 6 HR一步柱层析纯化，结合紫外(波长为254nm)检测系统收集抗原峰，然后利用反向间接血凝试验和感染性试验检测。结果显示，Superose 6 HR柱对口蹄疫病毒的分离纯化有一定效果，但根据阴性对照结果，抗原峰含有一部分水解乳蛋白和细胞成分；且经感染性检测结合血凝试验，抗原峰和后峰均含有完整病毒颗粒，彻底分离口蹄疫病毒较为困难，Marcelo等(2011)利用Sephacryl S-1000或S-400填料(G公司)分离纯化并定量口蹄疫病毒完整粒子，原理是通过分子排阻色谱来分离疫苗混合物中的不同组分，将146S分离出来，在波长254nm下的光吸收值来测定146S含量，检测范围为5～70μg/ml。优点是适用于不同的口蹄疫毒株；使用标准的层析介质，可以自动化操作；纯化后的样品的检测结果与蔗糖密度梯度离心分析法有良好的相关性。但未经纯化的样品检测结果与蔗糖密度梯度离心分析法相关性如何，还需设立对照试验进一步验证。

4 荧光定量RT-PCR法

苗海生等（2013）利用口蹄疫146S抗原ELISA定量技术抗原含量关系的标准抗原作为对照，通过对口蹄疫病毒的RNA进行检测，并进行待检样品与标准抗原曲线的对比，实现由病毒RNA荧光Ct值的测定向抗原含量的转变。此过程整个操作过程仅需要2h，可迅速根据标准曲线判断病毒悬液中病毒颗粒含量，节约生产成本。但本方法往往由于试剂、操作等因素的影响会产生一些误差，并且受研究技术水平的限制，绝对定量的精度和准确性还有待进一步提高。

5 展望

上述几种检测方法各有利弊，蔗糖密度梯度离心法对FMDV的血清型毒株没有限制，但无法检测多价成品疫苗各血清型病毒的抗原含量；ELISA方法操作相对简单，一次性可检测大量样品，但是制备单克隆抗体的过程复杂，并且对检测的病毒株有限制；凝胶过滤色谱法则自动化程度高，操作相对简单，但检测灵敏度及对杂质含量较高的样品分离效率目前不高，有待进一步的提高。

[1] Marcelo A S, Ignacio Fernandez, Erika S, et al．Foot and mouth disease(FMD) virus：quantification of whole virus Particles during the vaccine manufacturing process by size exclusion chromatograph[J].vaccine, 2011, 29: 7182-7187.

[2] 董金杰, 祁光宇, 刘学荣等. 用蔗糖密度梯度离心法检测与定量口蹄疫病毒抗原[A]. 第三届中国兽药大会－兽医生物制品学、兽医微生物学学术论坛文集[C]. 2010.

[3] 董金杰, 刘学荣, 陈苗苗等. 凝胶过滤层析法纯化口蹄疫病毒的试验[J]. 中国兽医科学增刊, 2007.

[4] Junsuke SHIRAI, Arinee CHATCHAWANCHONTEERA, et al.Estimation of 140S Particles in Foot-and-Mouth Disease Virus(FMDV)Vaccine by Using the computer Analyzing System. Jpn J Vet Sci, 1990,52(3): 621-630.

[5] Bartelingm, S. J. and Meloen, R. H. A simple method for the quantification of 140S particles of foot-and-mouth disease virus(FMDV).Arch Gesamte Virusforsch, 1974, 45: 362-364.

[6.李乐, 苗海生, 信爱国等. ELISA用于口蹄疫病毒146S抗原快速定量的研究[J]. 中国预防兽医学报, 2008, 30(4): 314-317.

S852.4+3

A

1007-1733(2017)10-0078-02

甘肃省科技支撑计划项目(1104NKCA081)

*通讯作者，

2017–05–11）