陈 芳, 黄丹丹, 王 芳

(1. 新疆医科大学第四附属医院, 新疆 乌鲁木齐, 830000;2. 新疆医科大学附属中医院, 新疆 乌鲁木齐, 830000;3. 新疆维吾尔自治区第四附属医院, 新疆 乌鲁木齐, 830000)



原因不明复发性流产患者蜕膜组织中蛋白激酶的表达及其与细胞凋亡的相关性研究

陈 芳1, 黄丹丹2, 王 芳3

(1. 新疆医科大学第四附属医院, 新疆 乌鲁木齐, 830000;2. 新疆医科大学附属中医院, 新疆 乌鲁木齐, 830000;3. 新疆维吾尔自治区第四附属医院, 新疆 乌鲁木齐, 830000)

目的 观察并分析蛋白激酶在原因不明复发性流产(URSA)患者蜕膜组织中的表达情况，及其与胎盘蜕膜细胞凋亡的相关性。方法 回顾性分析本院就诊的140患者，将其分成80例流产组和60例对照组。采用免疫组织化学染色法分别测定SGK在2组URSA患者蜕膜组织中的表达情况，同时采用DNA末端原位标记染色法(TUNEL法)分别检测流产组和对照组的细胞凋亡指数(AI)。结果 流产组患者蜕膜组织中SGK的阳性表达率为25.0%, 明显低于对照组的93.3%, 2组比较差异具有统计学意义(P<0.05); 流产组的平均细胞凋亡指数为明显高于对照组, 2组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 URSA患者蜕膜组织中蛋白激酶的表达降低，与组织细胞凋亡明显增加存在相关性。

蜕膜; 流产; 复发性凋亡; 蛋白激酶; 相关性

复发性流产(RSA) 在临床上的定义为连续发生3次或3次以上的流产，生育年龄妇女RSA发生率为1%～5%, 且有逐年上升趋势。随着流产次数的增加，自然流产发生的危险也在增加，在连续发生2次自然流产后，第3 次有高达80%妊娠胚胎丢失的危险。RSA已成为目前生殖医学领域中亟待解决的问题，但发病机制目前尚不十分明确。病因十分复杂，除了血栓形成倾向、染色体异常、生殖道病原体感染、子宫解剖结构异常和内分泌紊乱等因素外，约50%患者原因不明，而原因不明复发性流产(URSA)指的是致病原因不明确的RSA。目前育龄夫妇群体中RSA的发病率为1%～2%, 临床上不明原因复发性流产占复发性流产患者的比例高达50%, 因URSA的病因和发病机制尚未明确，其中大多与封闭抗体、HLA-G 表达异常、Th1/Th2平衡失调、NK细胞杀伤活性增强、自身免疫性抗体等免疫因素密切相关，至今仍未找到有效的治疗手段[1-2]。有研究[3-4]证实，子宫内膜细胞中血清和糖皮质激素调节蛋白激酶(SGK)含量的高低是受孕成功的关键因素，起着生育分子开关的重要作用。本研究探讨和分析URSA患者蜕膜组织中SGK的表达和作用，及其与细胞凋亡之间的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2009年3月—2013年3月来本院就诊的患者80例为流产组，平均年龄(25.6±3.52)岁，自然流史≥2次，既往无死胎、死产史，经妇科常规病因筛查，排除解剖、内分泌、染色体、自身免疫性及生殖道感染等方面的疾病。未曾服用对胎儿有不良反应的药物。正常妊娠组60例，为同期筛选的本院就诊的患者，平均年龄(24.6±3.65)岁，既往无自然流产、死胎史，排除解剖、染色体、内分泌的异常和自身免疫性及生殖道感染等方面的疾病。2组患者一般资料差异无统计学意义。

1.2 方法

将采集得到新鲜标本置于4%的中性甲醛溶液中固定，经常规脱水、石蜡包埋、连续切片(每张切片厚约5 μm)后，进行常规HE染色。用SP免疫组织化学染色法检测蜕膜组织中SGK的表达。所有切片均集中染色，避免组内、组间出现误差。实验设置阳性和阴性对照，由试剂公司提供阳性对照，统一采用TBS代替一抗作为阴性对照。采用DNA末端原位标记染色法(TUNEL)检测流产组和对照组的细胞凋亡指数，切片标本经过常规脱蜡至水、微波修复、30%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶后，加入TUNEL反应液及转化剂POD进行反应，再经二氨基联苯胺(DAB)显色、苏木素复染，脱水透明后封片。实验设置阳性和阴性对照，由试剂公司提供阳性对照，统一采用磷酸缓冲盐溶液(PBS)代替TUNEL反应液作为阴性对照。

1.3 结果判断

在光学显微镜下观察和分析切片，若细胞膜、细胞质内出现棕黄色颗粒则为阳性细胞。每张切片随机选取40个高倍镜视野，采用半定量积分法对结果进行判断。染色强度积分分级为: 无色: 0分；淡黄色: 1分；棕黄色: 2分；棕褐色: 3分。阳性细胞数积分分级: 小于总细胞数的5%为0分; 总细胞数的5%～20%为1分; 总细胞数的21%～50%为2分; 大于总细胞数的50%为3分。总积分等于染色强度积分与阳性细胞数积分相乘所得值，根据总积分大小划分成: 0分: 阴性(-); 1～3分: 弱阳性; 4～6分: 阳性(2+); ≥7分: 强阳性(3+)。将弱阳性(+)、阳性(2+)、强阳性(3+) 3者所占的百分比称为阳性率。

在光学显微镜下，凋亡细胞的细胞核着色呈棕黄色。每张切片随机选取40个高倍镜视野，计算出凋亡细胞数与总细胞数。细胞凋亡指数AI为阳性细胞数占总细胞数的百分比。

1.4 统计学处理

2 结 果

2组患者蜕膜组织均有SGK1的表达，对照组患者蜕膜组织中SGK1表达阳性率为93.3%, 平均染色分值为(5.85±1.35)分; 而流产组患者蜕膜组织中SGK1表达阳性率为25.0%, 平均染色分值为(1.05±0.96)分。2组比较显示，流产组中SGK1的表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)。染色后，对照组患者平均细胞凋亡指数 (2.87±1.07)%, 低于流产组患者的(8.19±3.58)%, 差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨 论

在免疫学上，妊娠常被认为是一个同种半异体的移植过程，母胎之间免疫平衡的调节关系到妊娠过程的成功与否，由蜕膜和绒毛外滋养层细胞组成母胎界面，滋养层细胞侵袭向子宫内膜层，然后开始进行迁移分化、调节植入胚，并开始侵袭母体血管。上述全过程启动子宫胎盘循环完成，子宫胎盘循环为胎儿提供供应营养物质和血液、进行排泄代谢产物和气体交换的场所。滋养层细胞维持Th1/Th2平衡的基础是能够分泌多种细胞因子。母体和胎儿直接接触面是蜕膜，蜕膜组织有着相当复杂的免疫细胞成分，蜕膜NK(dNK)细胞约占蜕膜免疫活性细胞总量的70%～80%, 是妊娠早期母胎界面的优势细胞，另外还有约占15%单核巨噬细胞和约占15% T淋巴细胞等。它们的功能、数量、表型与外周循环明显不同，局部免疫耐受或免疫应答的形成由这些变化决定，维持母胎免疫平衡。

临床上原因不明的复发性流产占复发性流产患者的比例较高，因此找到其有效的治疗手段是目前亟需解决的难题。按生殖免疫学的观点，胚胎作为半同种移植物，之所以能在母体中存活，有赖于免疫耐受机制的形成，使得其避开了母体免疫系统的排斥攻击，而原因不明的流产是一种失败的半同种移植结果，多数研究也证实妊娠妇女对胚胎半同种抗原的免疫耐受决定了妊娠的成功与否。由于失衡的遗传物质，常常可出现死胎和流产的现象，主要涉及9号染色体最多见，男性异常核型占9.5%，女性占13.2%。

蛋白激酶是主要的细胞内信息分子，参与了糖尿病性心血管病、低氧性肺动脉高压等多种疾病的发生。研究发现，蛋白激酶C在血管病变，如门脉高压等疾病的发生过程中也起重要作用。当胎盘代谢障碍时，此时环核甙酸(cANP、cHMF)水平发生改变，导致胎盘功能不全(PI), 环核甙酸磷酸化作用过程与cHMF-依赖蛋白激酶和cANP-激活相关。环核甙酸依赖蛋白激酶活性所显示的改变证明，在PI发病机制中胎盘蛋白磷酸化作用障碍可能起重要作用。

蛋白激酶在妊高征的发生中扮演了重要角色，妊高症患者蜕膜和胎盘绒毛上的细小动脉血管厚度明显增加，并且相对于正常妊娠者来说，其管壁纤维素样坏死率明显升高，说明胎盘绒毛血管管壁发生了重构。蛋白激酶C通道是最重要的细胞膜后信号传导途径之一，其通道由于酶活性增高，在慢性低氧时酶量增多，通道功能会因此发生显著上调。妊高征患者胎盘绒毛组织胞膜/胞浆蛋白激酶C-α比值明显高于正常妊娠妇女。免疫组化检测结果显示，妊高征患者胎盘细小动脉管壁蛋白激酶C-α明显比正常妊娠妇女表达高，提示妊高征患者胎盘绒毛蛋白激酶C-α表达异常及其活性增加，尤其是前胶原纤维Ⅰ增加，导致胎盘细小血管管壁增厚，尤其是重度患者，胎儿-胎盘单位灌注血流减少，减少胎儿供应血氧，最终限制胎儿生长。另一方面，胎盘血管血供减少，管壁增厚，进一步损伤胎盘血管内皮细胞，血管活性物质进一步增多，进而致孕妇全身的细小动脉发生痉挛性收缩，导致蛋白尿、高血压、水肿等一系列临床表现。进一步深入研究蛋白激酶C亚型及其在血管重构中的作用，有可能从蛋白和(或)基因水平认识原因不明的流产的机制，可有目的地使用特异性拮抗剂，通过蛋白激酶C在细胞内的活性及表达调控，滋养层细胞侵袭力降低，影响胚胎的植入和着床。胎儿与母体血流失调，而失调的胎盘血流不能为胎儿提供充足的氧气和营养物质，影响胎儿的发育和胚胎的生存。

妇女正常的生育能力与子宫内膜细胞中SGK的含量关系密切，作为生育分子开关的SGK, 其含量的高低是妊娠的关键调控因素，在受孕成功中起着关键的作用。目前，关于血清和糖皮质激素调节蛋白激酶(SGK)与URSA关系的研究不断深入[5-6]。邱添等[7-8]研究证实, RSA患者蜕膜组织中SGK1的表达低于健康人正常水平。本研究发现，对照组患者蜕膜组织中SGK1表达阳性率为93.3%，平均染色分值为(5.85±1.35)分; 而流产组患者蜕膜组织中SGK1表达阳性率为25.0%, 平均染色分值为(1.05±0.96)分, 2组比较差异有统计学意义。可知SGK在流产组患者蜕膜组织中的表达明显低于对照组，与邱添等的研究结果类似。

母体胎儿屏障滋养层和蜕膜组织的功能是正常的妊娠生理过程顺利进行的前提。在正常的妊娠过程中，滋养层细胞和胎盘蜕膜细胞不断进行细胞增殖和凋亡，使得组织结构得以不断改建维持妊娠，满足胚胎生长发育的需要。母体胚胎的正常发育需要子宫蜕膜组织提供必要的营养支持，细胞的凋亡可调整滋养层细胞侵入子宫内膜的深度，另一方面也保护着胚胎免受母体的免疫排斥，而自然流产的发生往往伴随着这种平衡状态的打破。胎盘的正常功能有赖于其血供的正常供给，当合体细胞的凋亡数目增加，胎盘的血管生长受到抑制，进而引起血供不足，胎盘功能出现障碍[9-11]。胎盘发育过程中若蜕膜细胞的凋亡过度，则胚胎发育停止，妊娠过程受阻，最终导致自然流产的发生[12-13]。妊娠中涉及的细胞凋亡过程重要而复杂。研究[14-15]表明，正常早期妊娠过程中均有细胞凋亡的发生，包括滋养细胞层的凋亡、胎盘结构的重塑以及蜕膜组织的退化与重建，任何环节出现凋亡异常，均会影响妊娠的正常发育，增加流产发生的可能性。本研究显示, URSA患者蜕膜组织中TUNEL阳性细胞数量增多，细胞凋亡指数(AI)明显高于正常早孕患者，这提示SGK在RSA患者蜕膜细胞凋亡过程中可能起着重要的作用。蜕膜组织的过度凋亡与蜕膜细胞中表达的SGK含量的减少有关，当SGK表达减少，机体抑制凋亡的能力随之下降，蜕膜组织出现过度凋亡，进而使得胎盘发育受阻，最终引发自然流产。

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Relationship between expression of SGK and apoptosis in uterine decidua in patients with unexplained recurrent spontaneous abortion

CHEN Fang1, HUANG Dandan2, WANG Fang3

(1. the Forth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi, Xinjiang, 830000; 2. Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medicine of Xinjiang Medical University, Urumqi, Xinjiang, 830000; 3. the Fourth Affiliated Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi, Xinjiang, 830000)

Objective To observe the expression of SGK in uterine decidua in patients with unexplained recurrent spontaneous abortion (URSA) and to investigate its role in the course of apoptosis. Methods The data of 140 patients in our hospital was retrospectively analyzed. The expression of SGK was detected by immunohistochemistry in decidua of URSA (abortion group,n=80) and normal first trimester pregnant women (control group,n=60). The apoptotic index was detected by TUNEL. Results Compared with the control group, the positive expression of SGK decreased significantly in the abortion group, and the difference was statistically significant(P<0.05). The average apoptotic index of the abortion group was significantly higher than that of the control group(P<0.05). Conclusion The positive expression of SGK is decreased in uterine decidua cells in patients with URSA, which is related to apoptosis.

decidua; abortion; recurrent apoptosis; protein kinases; correlation

2016-12-18

新疆维吾尔自治区教育厅基金(j281822)

R 714.21

A

1672-2353(2017)11-101-03

10.7619/jcmp.201711030