李世平 成姝婷 王正荣△

(1.四川大学华西第二医院儿科，出生缺陷与相关妇儿疾病教育部重点实验室；2.四川大学华西基础医学与法医学院，时间生物学卫生部重点实验室，四川 成都 610041)

综 述

非编码RNA调控精子发生的研究进展*

李世平1成姝婷2王正荣2△

(1.四川大学华西第二医院儿科，出生缺陷与相关妇儿疾病教育部重点实验室；2.四川大学华西基础医学与法医学院，时间生物学卫生部重点实验室，四川 成都 610041)

随着基因组学研究的发展，发现生物体基因组内存在大量不编码蛋白质的基因。这些基因的转录产物称为非编码RNA(Noncoding RNA，ncRNA)。以前认为ncRNA是基因组中无用的序列，但是研究表明ncRNA 在很多生命活动中起到很重要的作用。按照转录产物的序列长短ncRNA分为短链非编码RNA(Small ncRNA)和长链非编码RNA(LncRNA)。精子发生包括精原细胞增殖，精母细胞减数分裂以及精子成熟等一系列受到精确调控的生理发育过程。精子发生需要相关基因的适时表达，并受到转录和转录后水平的调控。但是精子发生过程的调控机制目前还未完全研究清楚。最新研究发现在精子发生过程ncRNA起到很重要的作用，即使在成熟精子细胞中也有ncRNA的表达。表明ncRNA参与调控精子发生的过程，并且这些父源ncRNA可能在接下来的受精和胚胎发育中起到重要的调节作用。结合最新研究进展，本文综述了ncRNA在精子发生过程所起的作用，以期为精子发生过程中ncRNA 的进一步研究提供参考。

ncRNA；精子发生；miRNA；piRNA；lncRNA

精子发生是雄性动物连续产生雄性配子的过程，即精原干细胞(Spermatogonial stem cells，SSCs)经历一系列严格调控的生理发育形成精子的过程。精子发生包括以下阶段：精原干细胞有丝分裂产生精母细胞；精母细胞经历两次减数分裂产生单倍体圆形精子细胞；精子形成即圆形精子细胞成为成熟的精子[1]。精子发生的每一个阶段都受到多种因素的精密调控，因此，阐明精子发生过程的分子机制，能够增强我们对于雄性生殖细胞发育基因调控的理解[2,3]。更有意义的是，为我们诊断和治疗男性不育打下坚实的基础。研究表明，非编码RNA(Noncoding RNA，ncRNA)参与精子发生过程调控[4]，参与精子发生过程ncRNA主要包括短链非编码RNA(Small ncRNA)和长链非编码RNA(LncRNA)，其中small ncRNA 主要有microRNA(miRNA)和piwi-interacting RNA(piRNA)[5]。ncRNA在生命活动很多过程中都具有很重要的作用，如调控基因表达、X染色体去活化(X-inactivation)、基因组印记、细胞分化、细胞凋亡、干细胞多能性、脑发育和精子发生等[6-9]。本文将结合最新研究进展，对miRNA、piRNA和lncRNA在精子发生过程中的调控作用进行综述。

1 短链非编码RNA对精子发生的调控

1.1 miRNA调节精子发生

miRNA是一种特殊的小分子RNA，他的大小大约为22 bp。现在已经发现了大量的miRNA，人类和小鼠基因组中分别存在超过1000种miRNA。这些miRNA在物种间具有高度保守的特性，而且有报道估计miRNA能够调节人类基因组超过30%的基因[10,11]。建立miRNA在雄性生殖细胞中表达谱，是全面研究miRNA在精子发生中调节作用的先决条件。虽然miRNA在雄性生殖细胞发育中的作用机制没有完全研究清楚，但是通过高通量表达谱研究发现，大量miRNA在精原细胞、粗线期精母细胞、精子细胞和成熟精子中选择性的表达[12,13]。

miRNA-20、miRNA-21和miRNA-106a能够调控精原干细胞(SSCs)的自我更新[14,15]。有些miRNA参与调控SSCs的增殖和凋亡，如：miRNA-204通过靶向Sirt1调控SSCs的增殖，而miR-34c能够影响SSCs的凋亡[16,17]。研究表明，miRNA122a在雄性生殖细胞末期大量表达，并且能够抑制圆形精子细胞的标志蛋白transition protein 2的表达。最新研究发现Translin(Testis-brain RNA binding protein)能够与miRNA122a结合，以增强miRNA122a在体内的稳定性[18]。与幼年小鼠的睾丸相比，成年小鼠的睾丸中miRNA34b的表达更高，显示miRNA34b可能在雄性生殖细胞分化中起到作用[19]。且近期研究发现miRNA34b和miRNA449在小鼠雄性生殖细胞发育过程中表达模式类似，参与调控精子形成，且表达异常导致雄性小鼠不育[20]。新生小鼠精原细胞培养3 d后miRNA17-92和miRNA290-295大量表达，说明这两类miRNA可能在精子发生过程中，对SSCs的增殖和早期分化起重要作用[21]。上述研究都表明miRNA在精子发生过程具有特异性表达，能够调控SSCs 的增殖，并参与精子生成及生殖细胞减数分裂中基因转录的调控，对维持雄性生殖细胞的正常发育起到调节作用。

1.2 piRNA调控精子发生

新近发现一种小分子RNA，由于他与piwi蛋白家族(如MIWI、MIWI2和MILI)相互作用，故称为piRNA[22]。与siRNA和miRNA不同，piRNA序列长度大约为24-30 bp，出现在精子发生过程的粗线期精母细胞和精子细胞中[23]。雄性和雌性生殖细胞的发育都需要piRNA的表达[24]。目前，已经发现了50000多种piRNAs，还有更多的piRNAs等待我们去发现，说明piRNA在很多生命过程都起到重要作用[25]。

piRNA与Piwi蛋白相互作用从而在精子发生过程中发挥作用。越来越多的研究表明，包括MIWI、MIWI2和MILI在内的亚家族piwi蛋白，是脊椎动物干细胞再生与雄性生殖细胞发育必须因子[24,26]。哺乳动物MIWI、MIWI2和MILI蛋白在生殖细胞中期和末期表达，他们是精子发生至关重要的蛋白[27-29]。MIWI蛋白是精母细胞一种细胞质蛋白，而且在圆形精子细胞的染色小体和胞质中都有表达。最重要的是MIWI蛋白与调节翻译和维持mRNA稳定的piRNA相关[30,31]。在Mili敲除小鼠中，精母细胞粗线期阶段精子发生受阻，且Mili表达降低、小鼠圆形精子不能形成成熟的精子[28]。Miwi2表达降低小鼠表现为减数分裂一期受阻，而且随着鼠龄的增长生殖细胞显著的减少[32]。表明与piwi蛋白亚家族相结合的piRNA可能参与雄性生殖细胞发育的减数分裂和减数分裂后的调节。而且piRNA只在处于粗线期精母细胞和圆形精子期的雄性生殖细胞中表达[33-35]，并在精子发生过程中起到抑制逆转录转座子的作用[29,36]。最新研究发现在粗线期精母细胞中显著表达的Nct1和Nct2非编码RNA是piRNA前体[37,38]。但是Nct1/2缺失小鼠2号染色体上一小簇piRNA表达降低。但是并不影响精子发生和生殖能力，说明在2号染色体上的这些piRNA对维持转座子的沉默起到重要作用[38]。

2 LncRNA对精子发生的调控

LncRNA是一类新的调节分子，没有明显的开放阅读框，能够被转录为序列长度大于200 bp的RNA[39,40]。哺乳动物基因组转录分析发现lncRNA是主要的转录RNA。大多数lncRNA是被RNA聚合酶Ⅱ转录，与编码蛋白的mRNA类似，具有5′甲基化帽和多聚腺苷酸尾[41]。但是与编码蛋白基因相比，lncRNA序列保守性很低，因此它一度被认为是“无用转录本”[42,43]。但是越来越多的证据表明lncRNAs并不是基因组的“无意序列”，它们在很多生理过程中起到很重要的作用，如X染色体去活化(X-inactivation)、基因印记、细胞分化、细胞凋亡、干细胞多能性、脑发育和精子发生等[9,44]。已有研究在雄性生殖细胞中发现大量lncRNA，但是只有很少一部分进行了功能的研究[45-47]。下面简要介绍一下在雄性生殖细胞中最新研究发现的lncRNA及其作用。

Mrhl(Meiotic recombination hot spot locus)是一段长2.4 kb的lncRNA，由Nishant和他们研究团队发现的[48]。Mrhl RNA存在于小鼠GC1期精原细胞的核仁中，与p68蛋白相互作用，阻断Wnt信号通路调控精子发生过程[49]。HongrES2是一种长度为1588bp，在附睾尾部特异性表达的lncRNA[50]。研究发现他在30天到450天的大鼠体内恒定的表达，也就是从第1轮的精子发生完成后开始。它主要在细胞核中表达，并被剪切为23 bp大小类似miRNA的小RNA——mil-hongrES2。mil-hongrES2能够抑制附睾特异性蛋白CES7的表达，并且增强其胆固醇酯酶活性。通过检测总酪氨酸磷酸化水平发现，过表达mil-hongrES2会阻碍精子获能[50]。

最初认为Tsx(Testis-specific X-linked)是一个编码蛋白基因，而最新研究表明他是一个lncRNA[51]。Anguera的研究团队发现Tsx在粗线期精母细胞特异性表达，但是在精原细胞和圆形精子细胞中没有表达，说明Tsx在生殖细胞减数分裂起到调节作用。通过TUNEL分析发现Tsx敲除小鼠，细胞凋亡出现异常，导致粗线期精母细胞在总的生殖细胞中异常的高比例，说明Tsx是减数分裂至关重要的基因。Dmr(Dmrt1-related gene)也是一种睾丸特异性lncRNA，是Zhang的团队在试图克隆Dmrt1基因时无意发现的[52]。Dmr位于第5号染色体，而Dmrt1位于第19号染色体。也就是说Dmr能够与Dmrt1形成一个反式剪切RNA亚结构。这种嵌合体mRNA的形成破坏了Dmrt1的编码区域，并且取代了Dmrt1基因的3′-UTR区，最终导致DMRT1蛋白表达的降低。然而，DMRT1又是一种通过上调Sohlh1的表达，促进精原细胞发育的转录因子；还能通过抑制Stra8的表达防止精母细胞不成熟的减数分裂[53,54]。Drm对Dmrt1表达抑制也可能参与生殖细胞发育过程中有丝分裂与减数分裂的转换[54]。

鉴于在睾丸发育和雄性生殖细胞中发现了大量的lncRNA表达，但是只有为数不多的几种研究了他们在雄性生殖细胞发育过程中的功能，因此lncRNA在精子发生的调控机制值得我们深入研究。

3 小结与展望

中心法则告诉我们蛋白质是各种细胞和分子功能的核心。翻译形成的蛋白质是生物体内发挥作用的大分子物质。但是，最新研究表明编码蛋白的基因在高等生物中所占的比例和低等生物相近。估计我们已知的编码蛋白的基因大约只占基因组的5%～10%。很大一部分转录的基因并不编码蛋白。以前认为ncRNA是基因组中无用的序列，但是研究表明ncRNA 在很多生命活动中其到很重要的作用。原核生物基因组ncRNA的量少于25%，简单的真核生物含有25%～50%的ncRNA，更加复杂的真菌，植物乃至动物基因组非编码DNA的量大于50%，而人类的含有接近98.5%的ncRNA[55]。已经有研究表明，ncRNA在精子发生过程中具有不可或缺的作用。ncRNA的发现为解释精子发生分子调节机制提供了新的思路，特别是对生殖细胞中调节增殖和分化的内源性基因调控机制的阐释。越来越多的研究表明ncRNA对精子发生和雄性生殖能力非常重要[56]。精子发生是一个复杂的，且由多方调控的生物过程。结合我们现有对ncRNA的认识，我们还没有完全明白ncRNA在精子发生过程中的作用。虽然现在的高通量实验技术和开放的ncRNA数据库资源，让我们发现了很多ncRNA，但是这些ncRNA在精子发生过程中的功能依然不清楚。这也提示我们研究ncRNA在精子发生过程中的调控机制具有巨大的研究潜力。

1 Griswold MD. Spermatogenesis: The commitment to meiosis[J]. Physiol Rev, 2016, 96(1): 1-17.

2 Komeya M, Ogawa T. Spermatogonial stem cells: progress and prospects[J]. Asian J Androl, 2015, 17(5): 771-775.

3 Morimoto H, Iwata K, Ogonuki N, et al. ROS are required for mouse spermatogonial stem cell self-renewal[J]. Cell Stem Cell, 2013, 12(6): 774-786.

4 Garcia-lopez J, Alonso L, Cardenas DB, et al. Diversity and functionalconvergence of small noncoding RNAs in male germ cell differentiation and fertilization[J]. RNA, 2015, 21(5): 946-962.

5 Zhang P, Kang JY, Gou LT, et al. MIWI and piRNA-mediated cleavage of messenger RNAs in mouse testes[J]. Cell Res, 2015, 25(2): 193-207.

6 Plasterk RH. RNA silencing: the genome′s immune system[J]. Science, 2002, 296(5571): 1263-1265.

7 Hung T, Wang Y, Lin MF, et al. Extensive and coordinated transcription of noncoding RNAs within cell-cycle promoters[J]. Nat Genet, 2011, 43(7): 621-629.

8 Yap KL, Li S, Mu Oz-cabello AM, et al. Molecular interplay of the noncoding RNA ANRIL and methylated histone H3 lysine 27 by polycomb CBX7 in transcriptional silencing of INK4a[J]. Mol Cell, 2010, 38(5): 662-674.

9 Mattick JS. Long noncoding RNAs in cell and developmental biology[J]. Semin Cell Dev Biol, 2011, 22(4): 327.

10Lewis BP, Burge CB, Bartel DP. Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are microRNA targets[J]. Cell, 120(1): 15-20.

11Keniry A, Oxley D, Monnier P, et al. The H19 lincRNA is a developmental reservoir of miR-675 that suppresses growth and Igf1r[J]. Nat Cell Biol, 2012, 14(7): 659-665.

12Moritoki Y, Hayashi Y, Mizuno K, et al. Expression profiling of microRNA in cryptorchid testes: miR-135a contributes to the maintenance of spermatogonial stem cells by regulating FoxO1[J]. J Urol, 2014, 191(4): 1174-1180.

13Yan N, Lu Y, Sun H, et al. A microarray for microRNA profiling in mouse testis tissues[J]. Reproduction, 2007, 134(1): 73-79.

14He Z, Jiang J, Kokkinaki M, et al. MiRNA-20 and mirna-106a regulate spermatogonial stem cell renewal at the post-transcriptional level via targeting STAT3 and Ccnd1[J]. Stem Cells, 2013, 31(10): 2205-2217.

15Niu Z, Goodyear SM, Rao S, et al. MicroRNA-21 regulates the self-renewal of mouse spermatogonial stem cells[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108(31): 12740-12745.

16Niu B, Wu J, Mu H, et al. miR-204 regulates the proliferation of dairy goat spermatogonial stem cells via targeting to sirt1[J]. Rejuvenation Res, 2016, 19(2): 120-130.

17Li M, Yu M, Liu C, et al. miR-34c works downstream of p53 leading to dairy goat male germline stem-cell (mGSCs) apoptosis[J]. Cell Prolif, 2013, 46(2): 223-231.

18Yu Z, Raabe T, Hecht NB. MicroRNA mirn122a reduces expression of the posttranscriptionally regulated germ cell transition protein 2 (Tnp2) messenger RNA (mRNA) by mRNA cleavage[J]. Biol Reprod, 2005, 73(3): 427-433.

19Barad O, Meiri E, Avniel A, et al. MicroRNA expression detected by oligonucleotide microarrays: System establishment and expression profiling in human tissues[J]. Genome Res, 2004, 14(12): 2486-2494.

20Wu J, Bao J, Kim M, et al. Two miRNA clusters, miR-34b/c and miR-449, are essential for normal brain development, motile ciliogenesis, and spermatogenesis[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2014, 111(28): E2851-2857.

21Hayashi K, Chuva De Sousa Lopes SM, Kaneda M, et al. MicroRNA biogenesis is required for mouse primordial germ cell development and spermatogenesis[J]. PLoS One, 2008, 3(3): e1738.

22Sarkar A, Volff JN, Vaury C. piRNAs and their diverse roles: a transposable element-driven tactic for gene regulation[J]. FASEB J, 2017, 31(2): 436-446.

23Gou LT, Dai P, Yang JH, et al. Pachytene piRNAs instruct massive mRNA elimination during late spermiogenesis[J]. Cell Res, 2014, 24(6): 680-700.

24Klattenhoff C, Theurkauf W. Biogenesis and germline functions of piRNAs[J]. Development, 2008, 135(1): 3-9.

25Huang Y, Bai JY, Ren HT. PiRNAs biogenesis and its functions[J]. Bioorg Khim, 2014, 40(3): 320-326.

26Reddien PW, Oviedo NJ, Jennings JR, et al. SMEDWI-2 is a PIWI-like protein that regulates planarian stem cells[J]. Science, 2005, 310(5752): 1327-1330.

27Deng W, Lin H. Miwi, a murine homolog of piwi, encodes a cytoplasmic protein essential for spermatogenesis[J]. Dev Cell, 2002, 2(6): 819-830.

28Kuramochi-Miyagawa S, Kimura T, Ijiri TW, et al. Mili, a mammalian member of piwi family gene, is essential for spermatogenesis[J]. Development, 2004, 131(4): 839-849.

29Carmell MA, Girard A, Van De Kant HJG, et al. MIWI2 is essential for spermatogenesis and repression of transposons in the mouse male germline[J]. Dev Cell, 2007, 12(4): 503-514.

30Grivna ST, Pyhtila B, Lin H. MIWI associates with translational machinery and PIWI-interacting RNAs (piRNAs) in regulating spermatogenesis[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 103(36): 13415-13420.

31Reuter M, Berninger P, Chuma S, et al. Miwi catalysis is required for piRNA amplification-independent LINE1 transposon silencing[J]. Nature, 2011, 480(7376): 264-267.

32Chuma S, Nakano T. piRNA and spermatogenesis in mice[J]. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 2012, 368(1609): 20110338-20110338.

33Aravin A, Gaidatzis D, Pfeffer S, et al. A novel class of small RNAs bind to MILI protein in mouse testes[J]. Nature, 2006, 442(7099): 203-207.

34Girard A, Sachidanandam R, Hannon GJ, et al. A germline-specific class of small RNAs binds mammalian Piwi proteins[J]. Nature, 2006, 442(7099): 199-202.

35Grivna ST, Beyret E, Wang Z, et al. A novel class of small RNAs in mouse spermatogenic cells[J]. Genes Dev, 2006, 20(13): 1709-1714.

36Aravin AA, Sachidanandam R, Girard A, et al. Developmentally regulated piRNA clusters implicate MILI in transposon control[J]. Science, 2007, 316(5825): 744-747.

37Iguchi N, Xu M, Hori T, et al. Noncoding RNAs of the mammalian testis: the meiotic transcripts Nct1 and Nct2 encode piRNAs[J]. Ann N Y Acad Sci, 2007, 1120: 84-94.

38Xu M, You Y, Hunsicker P, et al. Mice deficient for a small cluster of piwi-interacting RNAs implicate piwi-Interacting RNAs in transposon control[J]. Biol Reprod, 2008, 79(1): 51-57.

39Kapranov P, Cheng J, Dike S, et al. RNA maps reveal new RNA classes and a possible function for pervasive transcription[J]. Science, 2007, 316(5830): 1484-1488.

40Amaral PP, Clark MB, Gascoigne DK, et al. lncRNAdb: a reference database for long noncoding RNAs[J]. Nucleic Acids Res, 2011, 39(suppl 1): D146-D151.

41Guttman M, Amit I, Garber M, et al. Chromatin signature reveals over a thousand highly conserved large non-coding RNAs in mammals[J]. Nature, 2009, 458(7235): 223-227.

42Struhl K. Transcriptional noise and the fidelity of initiation by RNA polymerase II[J]. Nat Struct Mol Biol, 2007, 14(2): 103-105.

43Pang KC, Frith MC, Mattick JS. Rapid evolution of noncoding RNAs: lack of conservation does not mean lack of function[J]. Trends Genet, 22(1): 1-5.

44Mattick JS. The central role of RNA in human development and cognition[J]. FEBS Lett, 585(11): 1600-1616.

45Luk AC, Chan WY, Rennert OM, et al. Long noncoding RNAs in spermatogenesis: insights from recent high-throughput transcriptome studies[J]. Reproduction, 2014, 147(5): R131-R141.

46Bao J, Wu J, Schuster AS, et al. Expression profiling reveals developmentally regulated lncRNA repertoire in the mouse male germline[J]. Biol Reprod, 2013, 89(5): 107-107.

47Liang M, Li W, Tian H, et al. Sequential expression of long noncoding RNA as mRNA gene expression in specific stages of mouse spermatogenesis[J]. Sci Rep, 2014, 4: 5966.

48Nishant KT, Ravishankar H, Rao MRS. Characterization of a mouse recombination hot spot locus encoding a novel non-protein-coding RNA[J]. Mol Cell Biol, 2004, 24(12): 5620-5634.

49Arun G, Akhade VS, Donakonda S, et al. mrhl RNA, a long noncoding RNA, negatively regulates wnt signaling through its protein partner Ddx5/p68 in mouse spermatogonial cells[J]. Mol Cell Biol, 2012, 32(15): 3140-3152.

50Ni MJ, Hu ZH, Liu Q, et al. Identification and characterization of a novel non-coding RNA involved in sperm maturation[J]. PLoS One, 2011, 6(10): e26053.

51Anguera MC, Ma W, Clift D, et al. Tsxproduces a long noncoding RNA and has general functions in the germline, stem cells, and brain[J]. PLoS Genet, 2011, 7(9): e1002248.

52Zhang L, Lu H, Xin D, et al. A novel ncRNA gene from mouse chromosome 5 trans-splices with Dmrt1 on chromosome 19[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2010, 400(4): 696-700.

53Ottolenghi C, Veitia R, Barbieri M, et al. The human doublesex-related gene, DMRT2, is homologous to a gene involved in somitogenesis and encodes a potential bicistronic transcript[J]. Genomics, 2000, 64(2): 179-186.

54Agbor VA, Tao S, Lei N, et al. A Wt1-Dmrt1 transgene restores DMRT1 to sertoli cells of Dmrtl-/-testes a novel model of DMRT1-deficient germ cells[J]. Biol Reprod, 2013, 88(2): 51, 1-15.

55Cech TR, Steitz JA. The noncoding RNA revolution-trashing old rules to forge new ones[J]. Cell, 2014, 157(1): 77-94.

56Yadav RP, Kotaja N. Small RNAs in spermatogenesis[J]. Mol Cell Endocrinol, 2014, 382(1): 498-508.

Research progress of noncoding RNA in spermatogenesis*

LiShi-ping1, ChengShu-ting2, WangZheng-rong2△

(1.Key Laboratory of Birth defects and Related Diseases of Women and Children, Department of Pediatrics,West China Second University Hospital, Sichuan University; 2. Health Ministry Key Laboratory of Chronobiology,West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Sichuan Chengdu 610041)

国家自然科学基金资助(编号：31371108；31500935)

李世平，男，博士，主要从事生物节律与发育期神经损伤与修复，Email：iamlsp@163.com。

△通讯作者：王正荣，男，教授，主要从事生物节律研究，Email：wangzhengrong@126.com。

2017-4-5)