张霞，曾日彬，霍金龙*，王配，陈园园，王淑燕

（1.云南农业大学云南省版纳微型猪近交系重点实验室，昆明 650201；2.云南农业大学动物科学技术学院，昆明 650201）

版纳微型猪近交系RNF4基因克隆、多组织qPCR表达及功能生物信息学分析

张霞1,2，曾日彬1,2，霍金龙1,2*，王配1,2，陈园园1,2，王淑燕1,2

（1.云南农业大学云南省版纳微型猪近交系重点实验室，昆明 650201；2.云南农业大学动物科学技术学院，昆明 650201）

RNF4基因调节精细胞分化和增殖过程，文章以GenBank下载的猪及近缘物种RNF4mRNA序列为参考序列，设计特异引物扩增版纳微型猪近交系（BMI）RNF4基因。应用qPCR分析15个重要组织mRNA表达谱，并对蛋白质序列作功能生物信息学分析，构建多物种系统进化树。研究获得BMI RNF4 573 bp编码区序列（GenBank登录号：KU705638，对应氨基酸登录号：AOC89056），编码190个氨基酸，蛋白质分子质量（Mw）为21.43 ku，等电点（pI）为6.95。多组织荧光定量表达分析表明RNF4基因在尿道球腺、睾丸、肝、肺中高水平表达；在其他11个组织中呈中低水平表达。功能生物信息学分析表明RNF4蛋白质存在1个保守结构域，无跨膜结构，无信号肽序列；N末端疏水，C末端疏水；有4类功能活性位点，位于细胞核概率为94.1%。系统进化分析表明，BMI与狗亲缘关系最近。结果为研究RNF4基因在猪精细胞分化和增殖方面作用奠定基础。

RING指环；版纳微型猪近交系；组织表达；生物信息学

RNF4（指环蛋白）亦称SNURF，是一种核内转录因子[1]。通过酵母双杂交法发现，鼠RNF4可与雄激素受体（AR）DNA连接蛋白相互作用[2-4]。研究表明，RNF4与一些核蛋白类固醇激素信号蛋白激活或抑制和染色体建模等有关[5-7]。Pero等证明，RNF4基因在小鼠睾丸及不同日龄成年小鼠生殖细胞中高水平表达，但在精子形成过程中各阶段表达量不同[8]，体细胞中低水平表达[9-10]。Yin等研究表明，RNF4是一种高度保守的小泛素类调节物，对DNA损伤细胞应答反应及同源重组起关键作用[11]。RNF4基因主要在精细胞分化和增殖过程起调节作用[8]。

版纳微型猪近交系（Banna Mini-pig inbred line, BMI）是世界上首个培育成功的猪近交系，其基因高度纯合、遗传背景清楚，生理生化、解剖和疾病发生机理等与人类相似，可为新药临床应用前的安全性评价、猪基因组计划中功能基因研究、人类疾病动物模型制作和人类异种器官移植等提供良好器官供体，具有重要科研价值和应用前景[12-15]。随公猪遗传改良、配种等生殖性能方面需求提升，版纳微型猪近交系部分亚系公猪雄性不育成为重要研究方向。本研究通过克隆BMI RNF4基因，分析其核酸序列特征；mRNA多组织荧光定量表达谱确定其发挥功能重要组织；功能生物信息学分析预测其蛋白质功能，为今后深入研究指环蛋白（RNF4）基因在公猪雄性生殖中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样品与试剂

1.1.1 样品

屠宰BMI耳号为0847成年公猪，取心脏、肝、脾、肺、肾、胃、脑、肌肉、十二指肠（代表小肠）、结肠（代表大肠）等常规组织，以及副性腺（前列腺、精囊腺、尿道球腺）和性腺（睾丸、附睾）等15种重要组织样品。

1.1.2 试剂

RNA提取、反转录、SYBR荧光定量等试剂及试剂盒均购自TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取和cDNA合成

利用RNA提取试剂盒提取各组织总RNA，分别用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测RNA浓度及纯度、完整性，反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。

1.2.2 引物设计及合成

根据GenBank下载人（HSU95140）、绵羊（XM_ 004010018）、牦牛（XM_005894426）、马（XM_ 008528091）等物种RNF4mRNA序列，结合猪表达序列标签EST序列（BI181237和BP157988），参照GenBank下载猪RNF4 mRNA标准序列（XM_005 666484），利用Oligo7引物软件设计F1/R1特异引物扩增RNF4基因全长CDS序列及部分UTR序列，设计F2/R2特异引物并以GAPDH基因为内参作多组织mRNA荧光定量表达分析，引物信息见表1。

表1 RNF4和GAPDH引物信息Table 1 Prim er information of RNF 4 and GAPDH genes

1.2.3 PCR扩增反应体系及程序

PCR反应总体系25μL，包括：17.75μLRNA free H2O，2.5μL 10×Ex Taq Buffer，2μL dNTP，1.5μL 50 ng·μL-1睾丸cDNA模板，各0.5μL 10 μmol·L-1上、下游引物，0.25μL 5 U·μL-1Ex Taq酶。运行程序：95℃3min；95℃30 s，60℃40 s，72℃80 s，循环30次；72℃延伸5min结束。产物经电泳检测正确后测序。

1.2.4 多组织荧光定量表达分析

以各组织cDNA为模板，GAPDH为内参基因，F2/R2为特异引物，利用Eppendorf的Mastercycler ep realplex4荧光定量PCR仪qPCR扩增。首先以睾丸cDNA作模板，以50 ng·uL-1为起始浓度，5倍倍比稀释获得7个标准品，同时设置阴性对照NTC和3个重复，制作标准曲线。以15个组织样品cDNA为模板以GAPDH为内参作qPCR扩增。扩增体系为20μL：10μL 2×SYBR试剂，6.8μL ddH2O，2μL cDNA模板，各0.6μL 10μmol·L-1上、下游引物F2/R2。运行程序：95℃30 s；95℃5 s；56℃30 s；72℃30 s,循环40次；添加熔解曲线，95℃15 s，60℃15 s，采集荧光信号20 min，95℃15 s结束程序。

1.2.5 序列确定和数据分析

利用DNAstar软件比对校正测序结果并作序列拼接，确定RNF4编码序列并推导其氨基酸序列。2-ΔΔCt法计算各组织mRNA相对表达水平。作RNF4蛋白质功能生物信息学分析，构建多物种系统进化树。

2 结果与分析

2.1 RNF4基因PCR扩增结果

以睾丸cDNA为模板，采用F1/R1引物作PCR扩增，电泳检测扩增产物长度与设计引物时预期片段一致，长度为1 302 bp，见图1。

图1 RNF4基因反转录PCR扩增结果Fig.1 RT-PCR resu lt of RNF4 gene

2.2 RNF4基因序列及其编码氨基酸序列

利用F1/R1扩增产物测序BMI RNF4全长编码序列573 bp，获得GenBank数据库认证，mRNA登录号为KU705638，其对应氨基酸登录号为AOC 89056。编码190个氨基酸，含有1个保守结构域，见图2。

图2 RNF4基因编码区全长序列与翻译的氨基酸序列Fig.2 Full length coding sequenceand am ino acidssequenceof RNF4

2.3 多组织荧光定量表达分析

以GAPDH为内参基因，利用睾丸cDNA制作RNF4标准曲线，为y＝-3.238x+27。扩增效率E＝103%，相关系数R2＝0.993。利用qPCR检测RNF4基因在BMI 15种组织中表达量，ΔCtmax为肌肉组织，ΔCtmin为尿道球腺组织。根据计算结果用2-ΔΔCt法分析各组织qPCR相对表达水平绘制柱状图，结果表明RNF4基因mRNA在尿道球腺、肝、睾丸、肺中高表达（由高到低）；在十二指肠、前列腺、精囊腺中呈中度表达（由高到低）；在脾、肾、结肠、脑、附睾、心脏中低表达（由高到低）；在肌肉、胃中不表达，见图3。

2.4 RNF4蛋白质一级结构信息

ProtParam tool程序预测BMIRNF4蛋白质一级结构信息和理化性质见表2。

2.5 RNF4蛋白质二级结构

SOPMA程序预测的BMIRNF4蛋白质二级结构为：38.95%无规则卷曲（含74个氨基酸），28.95% α-螺旋（含55个氨基酸），20%延伸链结构（含38个氨基酸），12.11%β-转角（含23个氨基酸），见图4。

图3 RNF4基因荧光定量多组织表达谱Fig.3 M ulti-tissuesqPCR expression profileof RNF4 gene

表2 RNF4蛋白质一级结构信息Table 2 Primary structu re information of RNF4 protein

图4 RNF4蛋白质二级结构Fig.4 The secondary structureofRNF4 protein

2.6 RNF4蛋白质功能域

SMART程序预测BMIRNF4蛋白质功能域，发现其在132-180 AA是蛋白功能域，见图5。

图5 RNF4蛋白质功能域Fig.5 Protein function dom ain of RNF4 protein

2.7 RNF4蛋白质疏水性

ProtScale程序预测BMIRNF4蛋白质疏水性，N和C末端均疏水，在氨基酸第132位置有最大疏水值1.344，在第75位置有最小疏水值-3.844，见图6。

2.8 RNF4蛋白质功能位点分析

Prosite程序预测BMIRNF4蛋白质功能位点，BMIRNF4蛋白质含有4类功能活性位点，包括N-糖基化位点、蛋白酶C、酪蛋白激酶II等磷酸化位点和N-十四酰化位点，见表3。

2.9 RNF4蛋白质跨膜结构、信号肽及在细胞中定位位置分析

TMHMM 2.0程序预测BMIRNF4蛋白质跨膜区，结果显示BMIRNF4蛋白质不存在跨膜螺旋；SignalP 4.1程序预测信号肽，显示该蛋白质无信号肽序列；PSORTⅡ程序进行蛋白质在细胞中定位位置分析，显示该蛋白质可能位于细胞核概率为94.1%。

图6 RNF4蛋白质疏水性分析Fig.6 Hydropathy analysis resultof RNF4 protein

表3 RNF4蛋白质功能活性位点Tab le3 Functionalactive siteofRNF4 protein

2.10 RNF4蛋白质序列多物种系统进化分析

利用DNAstar、ClusterX1.83和MEGA7.0等生物学软件将BMIRNF4蛋白质序列与狗（XP_853 173）、人（NP_002929）、黑猩猩（XP_008963739）、牛（NP_001040054）、羊（XP_012035821）等5个物种蛋白质序列作比对并计算相似度，相似度分别为：95.3%、93.7%、93.7%、91.4%、90.5%。构建6个物种分子系统进化树，见图7。

图7 6个物种RNF4蛋白质序列构建系统进化树Fig.7 Phylogenetic tree RNF4 protein sequencesof six species

3 讨论

随着RNF4基因结构与功能研究深入，RNF4基因突变可导致细胞及DNA损伤[17]。目前RNF4基因已在大鼠、小鼠[8]及人类[10]中被分离并试验鉴定。本研究根据GenBank数据库中下载人、牛、羊、马等物种RNF4mRNA序列比对，设计特异性引物，首次获得BMI的RNF4基因CDS序列，并分析多种组织表达图谱。

以GAPDH为内参对照校正的qPCR多组织表达谱分析表明RNF4基因在BMI猪性腺睾丸、副性腺尿道球腺中高表达，在其他组织肝、肺中表达水平较高，且各被检组织中表达差异显著，Pero等发现RNF4基因主要在小鼠睾丸中高表达[8]，但未检测尿道球腺、肝脏和肺脏样品表达情况。该基因在各组织间表达差异可能与其组织功能差异有关，由此推断该基因主要在猪睾丸和尿道球腺中发挥重要功能，今后可深入探索该基因在肝脏和肺脏中功能。

蛋白质结构与功能间存在相关性[18]。功能生物信息学分析显示，BMIRNF4蛋白含有较多无规则卷曲螺旋，无规卷曲经常构成酶活性部位和其他蛋白质特异功能部位[18]。RNF4蛋白有一个RING结构域[9]，Pero等研究发现，指环蛋白与肿瘤发生有关，RNF4基因抑制生殖细胞肿瘤干细胞生长[10]。BMIRNF4蛋白不包含信号肽序列，属于非分泌性蛋白，在游离核糖体上合成后无需内质网-高尔基体分泌途径修饰，可直接释放到细胞质基质中。RNF4蛋白无跨膜螺旋说明其属于非跨膜蛋白。糖基化和磷酸化是蛋白质化学修饰两种主要方式，RNF4蛋白糖基化和磷酸化位点的发现，可为后续RNF4蛋白在精细胞分化和增殖过程中功能研究奠定基础。

BMIRNF4蛋白质序列与人、黑猩猩、狗、牛及羊等5个物种的RNF4蛋白质序列相似性比对分析表明，相似性均在90%以上，说明RNF4基因在进化中高度保守。通过体外试验发现，该蛋白不会随体外培养时间增加而功能下调，可能与控制蛋白降解机制有关，说明该蛋白稳定性较好[8]。6个物种RNF4蛋白质序列构建的系统进化树表明人和黑猩猩聚为一小类，再与狗聚为一类，最后与猪聚为一大类，人和黑猩猩均属于灵长目，狗为犬科动物，猪为猪科动物，均为哺乳纲动物，猪和狗是重要的家养驯化动物；牛和羊聚为一类，均属于牛科，三大支分类均符合系统进化分类标准。

4 结论

综上所述，本研究利用RT-PCR方法成功分离BMI RNF4基因全长编码序列，采用qPCR确定其在BMI 15种组织中表达情况，进一步对其编码蛋白质作功能生物信息学分析，包括基本信息、结构域和功能位点、多物种比对及相似性，研究结果可为深入研究猪RNF4基因功能奠定基础。

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Cloning, muti- tissues qPCR expression and functional bioinformaticsanalysis of Banna mini-pig inbred line gene RNF4

ZHANG Xia1,2,ZENG Ribin1,2,HUO Jinlong1,2,WANG Pei1,2,CHEN Yuanyuan1,2,WANG Shuyan1,2
(1. Key Laboratory of Banna Mini-pig Inbred Line of Yunnan Province, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China; 2. School of Animal Science and Technology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China)

RNF4 gene plays a regulater of sperm cell differentiation and proliferation process. The RNF4 mRNA sequence of pig and related species from GenBank was used as reference sequences, We designed specific primers and amplified Banna mini-pig inbred line (BMI) RNF4 gene. qPCR was applied to analysis the mRNA expression profiles of 15 important tissues. Protein sequence was used to carry out functional bioinformatics analysis and construct phylogenetic tree. A coding sequence of 573 bp (GenBank accession number: KU705638, the corresponding amino acid sequence accession number: AOC89056) ofBMI RNF4 was obtained, which encodes a protein of 190 amino acids, protein molecular weight 21.43 ku, and isoelectric point 6.95. Fluorescence quantitative expression indicated that RNF4 gene expressed highly in the antiprostate, testis, liver, lung, and low expression in the other 11 tissues. Functional bioinformatics analysis indicated that RNF4 protein contained one conserved domains, no transmembrane region, no signal peptide sequences; its N-terminal and C-terminal were hydrophobic; it has four kinds functional active sites and a percentage 94.1 to located in cell nucleus. Phylogenetic analysis demonstrated that BMI had the closest relationship with dog. The results of the study will lay a foundation for further study of the gene about its functions in pig sperm cell differentiation and proliferation.

RING finger;Bannam ini-pig inbred line(BMI);tissue expression;bioinform atics

Q78

A

1005-9369（2017）03-0024-07

时间2017-3-21 13:57:00[URL]http://kns.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20170321.1357.006.htm l

张霞,曾日彬,霍金龙,等.版纳微型猪近交系RNF4基因克隆、多组织qPCR表达及功能生物信息学分析[J].东北农业大学学报,2017,48(3):24-30.

Zhang Xia, Zeng Ribin, Huo Jinlong, et al. Cloning, muti-tissues qPCR expression and functional bioinformatics analysis of Banna mini-pig inbred line gene RNF4[J]. Journal of Northeast Agricultural University, 2017, 48(3): 24-30. (in Chinese with English abstract)

2017-01-20

国家自然科学基金项目（31660637，31460580，31660650）

张霞（1990-），女，硕士研究生，研究方向为动物分子遗传学。E-mail:2574705914@qq.com

*通讯作者：霍金龙，副教授，博士，研究方向为动物分子遗传学。E-mail:jinlonghuo973@163.com