杨雪鸥　杨露茜　袁涛　余正文　张林

摘要：提取细叶鼠曲草（Gnaphalium japonicum Thunb）总黄酮，比较传统水溶性提取与超声提取总黄酮的工艺差异，并通过单因素和正交试验优化细叶鼠曲草總黄酮提取工艺。结果表明，超声醇提效果较好，条件为超声时间30 min、乙醇体积分数80%、提取温度60 ℃、料液比1∶30（g/mL），提取总黄酮含量为2 mg/g。

关键词：细叶鼠曲草（Gnaphalium japonicum Thunb）；总黄酮；超声提取；正交试验

中图分类号：TQ461 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）04-0712-04

细叶鼠曲草（Gnaphalium japonicum Thunb）为菊科鼠曲草属植物，鼠曲草属植物全世界共有200多种，分布广泛，资源蕴藏量大。中国鼠曲草属植物有20余种[1]，在民间有相当长的使用史，俗称“面蒿”、“清明菜”，是具有浓郁民族资源特色的食品[2]；同时也是丰富的药用资源，广泛用于痛风、炎症、痈疮肿毒、肠炎痢疾、活血止血等病症[3-6]，细叶鼠曲草就是其中的一种。细叶鼠曲草主要分布在中国长江以南的地区，贵州省江口、贵阳、平塘、荔波、雷山均有分布，生长在海拔780～1 200 m的山坡阳处草地，全草入药，性甘平，清热利湿，解毒清肿，主治结膜炎、咽喉肿痛、尿道炎[7]；畲族同胞常用于治疗肝炎疾病，疗效显著[8]。前人的研究表明，鼠曲草属植物的主要化学成分为黄酮和二萜类[9-11]。尚未见细叶鼠曲草提取纯化相关化学成分方面的研究报道。本研究首次通过筛选细叶鼠曲草总黄酮提取工艺，获得提取优化工艺条件，为今后进一步分离纯化细叶鼠曲草总黄酮获得有效成分提供参考，也为该资源的深入开发利用创造条件。

1 材料与方法

1.1 试验仪器与材料

721型紫外分光光度计（天津冠泽科技有限公司）；HB-10250型数控超声仪（江苏汉邦科技有限公司）；BS210S型电子天平（北京赛多利斯天平股份公司）；EYELA N-1100型旋转蒸发仪（倍捷科技有限公司）。

细叶鼠曲草采集于贵州省江口县，经贵州省农业植物鉴定专家孟祥顺鉴定为菊科植物细叶鼠曲草；芦丁由中国药品生物制品检定所提供；其他试剂均为分析纯。

1.2 试验方法

1）细叶鼠曲草的提前处理。取细叶鼠曲草样品于60 ℃烘箱中干燥3 h，粉碎后移入干燥器中保存待用。

2）细叶鼠曲草总黄酮提取方法考察。细叶鼠曲草粉末→60%乙醇浸泡0.5 h→回流3次，合并滤液，回收乙醇→定容→供试液A。细叶鼠曲草粉末→60%乙醇浸泡0.5 h→超声3次，合并滤液，回收乙醇→定容→供试液B。细叶鼠曲草粉末→蒸馏水浸泡0.5 h→回流3次，合并滤液→定容→供试液C。细叶鼠曲草粉末→蒸馏水浸泡0.5 h→超声3次，合并滤液→定容→供试液D。

3）测定波长的选择。精密量取供试品溶液和对照品溶液适量，按标准品的方法进行显色，在波长为200～800 nm处对供试样品溶液和对照品溶液扫描。供试品和对照品均在510 nm处有最大吸收峰，故确定510 nm为测定波长。

4）标准曲线的绘制。精密移取芦丁1 mg/mL对照品溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL置于5个10 mL的量瓶中，加入5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀并放置6 min，加入10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀并放置6 min，加入4%氢氧化钠溶液4 mL，加入60%乙醇至刻度，摇匀并放置15 min，以60%乙醇溶剂为空白对照，于510 nm处测定吸光度。以芦丁含量为横坐标，吸光度为纵坐标作图，计算线性回归方程为y=0.147x+0.086，R2=0.992（n=5），结果显示芦丁浓度在20～60 μg/mL时具有良好线性关系。

5）细叶鼠曲草总黄酮含量的检测。取供试液用60%乙醇定容至100 mL，取1 mL按标准品方法显色，测定吸光度，并根据标准曲线计算样品中总黄酮含量，即总黄酮含量=提取物总黄酮质量/细叶鼠曲草质量。

6）单因素试验。选择适宜的溶剂和提取方法，对影响细叶鼠曲草总黄酮提取的可能因素，包括超声时间、乙醇体积分数、提取温度和料液比4个因素进行考察。在此过程中，以所得提取液的总黄酮含量作为考察指标，考察单因素对细叶鼠曲草总黄酮提取工艺的影响。

7）正交试验。为全面考察影响因素，优化黔细叶鼠曲草中总黄酮的工艺提取条件，在单因素试验的基础上，选定超声时间（A）、乙醇体积分数（B）、提取温度（C）、料液比（D）为考察因子，每个因素各取3个水平，按L9（34）正交表进行正交试验（表1），以细叶鼠曲草总黄酮含量为考察指标，确定最佳工艺条件。

8）验证试验。为进一步验证最佳工艺的可靠性，以优化工艺进行细叶鼠曲草总黄酮提取试验，重复3次，测定获取细叶鼠曲草总黄酮的含量。

2 结果与分析

2.1 提取工艺优选

分别称取药材2 g，加50倍量60%乙醇，浸泡0.5 h，进行回流提取和超声提取各3次，合并回收乙醇至无醇味，用60%乙醇定容于100 mL量瓶中，得供试液A和B。分别称取药材2 g，加50倍量蒸馏水，浸泡0.5 h，进行回流提取和超声提取各3次，合并回收乙醇至无醇味，用60%乙醇定容于100 mL量瓶中，得供试液C和D。结果显示乙醇超声提取优于其他方法，故选择乙醇超声提取作为总黄酮提取的方法（表2）。

2.2 单因素水平的确定

2.2.1 乙醇体积分数 分别准确称取2 g干燥的黔细叶鼠曲草粉末5份，分别加入50%、60%、70%、80%、100%的乙醇溶液各60 mL，在温度70 ℃、100 W超声波功率的条件下超声30 min，抽滤，定溶到100 mL，每次取1 mL，按标准品的方法进行显色测其吸光度（图1）。由图1可知，乙醇体积分数增加有利于提取含量的增高，但不是越高越好。随着乙醇体积分数的提高，细叶鼠曲草总黄酮含量得以提高。当乙醇体积分数达到60%时，提取总黄酮含量达最大值，继续增加乙醇体积分数，提取总黄酮含量增加不显著。当乙醇体积分数大于80%时提取总黄酮含量迅速降低，其原因可能是乙醇体积分数大于80%时，提取液杂质增加，溶液颜色变深，干扰紫外检测因素增加。因此，筛选乙醇体积分数60%～80%的范围作为进一步优化范围。

2.2.2 料液比 分别准确称取2 g干燥的黔细叶鼠曲草粉5份，按1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g/mL，下同）的料液比加入乙醇溶液，在70 ℃、100 W超声功率的条件下超声30 min，抽滤，定容到100 mL，每次取1 mL，按标准品方法显色，测定吸光度（图2）。由图2可知，适当增加溶剂有利于细叶鼠曲草总黄酮的溶出，当料液比达到1∶30时，提取细叶鼠曲草总黄酮效果最好；然而继续增加溶剂用量，提取总黄酮含量有所下降，究其原因可能与杂质含量随溶剂量增加而增大有关，并且溶剂量的增大势必增大工艺提取成本，造成浪费。因此综合考虑各方面因素，选择料液比1∶20～1∶40作为进一步优化的范围。

2.2.3 超声时间 准确称取2 g干燥的鼠曲草粉5份，分别加入60 mL 60%乙醇，在70 ℃、100 W超声波功率的条件下分别提取20、30、40、50、60 min，抽滤，定容，按标准品显色方法测定吸光度（图3）。由图3可知，超声时间控制在30 min左右，所提细叶鼠曲草总黄酮含量达到最大，当超声时间超过30 min，提取总黄酮含量有所下降。因此筛选超声时间20～40 min作为进一步优化的范围。

2.2.4 提取溫度 分别准确称取2 g干燥的鼠曲草粉5份，分别加入60 mL 60%乙醇，在70 ℃、100 W的超声条件下分别于30、40、50、60、70 ℃超声30 min，抽滤，定容到100 mL，每次取1 mL，按标准品显色方法测定吸光度（图4）。由图4可知，适当提高提取细叶鼠曲草的温度，有利于总黄酮的溶出。温度的增加，有利于溶剂分子的热运动，增加渗透扩散溶出的速度，提高了总黄酮的浓度，且温度控制在70 ℃时提取效果最好，当温度进一步提升，将增加细叶鼠曲草其他杂质的溶出，降低总黄酮含量。因此，选择提取温度60～80 ℃作为进一步优化的范围。

2.3 正交试验设计及分析

为综合考察细叶鼠曲草总黄酮提取工艺影响因素的交叉效果，根据上述单因素试验结果及参考相关资料，确定以超声时间（A）、乙醇体积分数（B）、提取温度（C）和料液比（D）4个考察因素考察药材总黄酮含量，采用L9（34）正交表进行设计。由表3、表4可知，各因素对细叶鼠曲草总黄酮提取影响的顺序为C>A>B>D，即提取温度>超声时间>乙醇体积分数>料液比。并且提取温度对提取细叶鼠曲草总黄酮有显著影响，其他3个因素对结果的影响不显著。因此，通过比较试验结果，筛选出的最优试验条件为超声时间30 min、乙醇体积分数80%、提取温度60 ℃、料液比1∶30。

2.4 验证试验

精密称取细叶鼠曲草2 g，共3份，按最佳工艺提取，药液过滤，浓缩，定容于100 mL量瓶中。精密量取提取液1 mL定容于10 mL量瓶中，按照标准品显色方法测定吸光度，按照结果显示最佳工艺提取3组药液，所得细叶鼠曲草总黄酮吸光度为0.542、0.481、0.530，平均含量2 mg/g，试验结果高于正交试验其他组合，所得试验结果稳定可行。

3 小结与讨论

细叶鼠曲草作为一种贵州省民间药食两用的植物流传甚广，主要成分为黄酮和二萜类，然而目前深入研究开发的报道不多，仅局限于生药学、理化性质鉴定等方面[7]。本试验开创性地对细叶鼠曲草总黄酮提取工艺进行了研究，取得了一定的成果。通过正交试验，得到细叶鼠曲草在提取时间30 min、乙醇体积分数80%、提取温度60 ℃、料液比1∶30时提取效果最好，所得总黄酮含量为2 mg/g。另外，继续筛选其他方法提取细叶鼠曲草总黄酮，不失为提高提取条件的优良策略。比如微波提取法、碱性（酸性）稀醇提取法、酶法提取、热压流体萃取、超临界流体萃取等。

参考文献：

[1] 祁承经，喻勋林.湖南种子植物总览[M].长沙：湖南科学技术出版社，2002.

[2] 张慧颖，孙 赟，饶高雄.鼠曲草属药用植物化学成分及药理作用研究进展[J].中国民族民间医药，2012，8（15）：60-63.

[3] LIN W Q，XIE J X，WU X M. Inhibition of xanthine oxidase activity by Gnaphalium affine extract[J].Chinese Medical Science，2014，29（4）：225-230.

[4] HUANG D D，CHEN Y H，CHEN W S，et al. Anti-inflammatory effects of the extract of Gnaphalium affine D. Don in vivo and in vitro[J].Ethnopharmacology，2015，176：356-364.

[5] XI Z X，CHEN W S，WU Z J，et al.Anti-complementary activity of flavonoids from Gnaphalium affine D. Don[J].Food Chemistry，2012，130（1）：165-170.

[6] 中国医学科学院药物研究所.中药志（第四册）[M].北京：人民卫生出版社，1988.

[7] 陈艺林，石 铸.贵州植物志（第九卷）[M].成都：四川民族出版社，1989.

[8] 胡 恩，陈坤全，陈清容.治平畲族乡畲族同胞常用于治疗肝炎的中草药简介[J].中国民族民间医药杂志，2006（3）：159-160.

[9] 江苏省植物研究所.新华本草纲要（第三册）[M].上海：上海科学技术出版社，1990.

[10] TAMARA L，MERAGELMAN，GLORIA L，et al. Ent-pimarane type diterpenes from Gnaphalium gaudichaudianum[J].Phytochemistry，2003，62：569-572.

[11] RUBEN T，JULIO P，JORGE R，et al.Diterpenes from Gnaphalium pellitum and Gnaphalium graveolens[J].Phytochemistry，1992，7（31）：2415-2418.